PCR序列拼接软件Contig Express使用简介.docVIP

PCR序列拼接软件Contig Express使用简介 ??1 - Contig Express的基本情况 大家做分子生物学实验最多的步骤可能就是PCR了。PCR之后一般要进行测序以保证扩增序列的正确性。由于测序能力的限制，目前最好的公司也只能保证一个反应800bp测准。如果大家的克隆片断大于1k，那么势必要同时测两个反应，然后将两个反应得到的序列利用其相互重叠的部分进行拼接，这样才能得到完整的PCR产物序列。怎样拼接呢？有的公司还比较厚道，会帮助您拼好；可使大多数公司碰到这种情况只会将几个片断丢给您自己让您DIY。 Contig Express是著名的软件Vector NTI的组件之一。经过一些简单的处理该组件可以被剥离出来独立运行，经我们试用效果良好。Contig Express将每个PCR测序片断视为一个Contig，当您输入多个Contig后，它会自动寻找其中的公共序列，然后将他们拼接好后的结果已图形方式呈现给您。完全免除您手工逐个片断Blast，然后肉眼找共同序列的苦恼。 Contig Express 9.1可以从论坛中下载。 2 - 向Contig Express中加入需要拼接的序列 目前PCR测序的结果多以ABI和Fasta两种格式提供。一般来说ABI结果是原始结果最为可信，因此我们最好向Contig Express中直接倒入ABI格式的原始数据。 倒入的方法是Project---Add Fragments---From ABI file...。 在接下来弹出的Import Sequence From对话框中选择测序公司发给您的ABI文件。需要注意的是目前公司发给您的原始ABI文件多是AB1文件名。Contig Express无法直接识别，因此有必要在文件类型中选择“All Files(*.*)。由于要拼接多个序列这时您可以配合Ctrl键进行多选。 3 - 用Contig Express进行序列拼接 现在我们已经选好了要进行拼接的序列了，接下来的步骤就交给Contig Express让它为我们自动拼接了。用鼠标配合Ctrl键选择要进行拼接的序列。然后点击Assemble---Assemble Selected Fragments。 拼接的过程一闪而过。在接下来的对话框中显示出这两个PCR片断拼接得到的“Contig1”。用鼠标双击“Contig 1”。 在下面这幅图中形象地显示出这次拼接的结果。上下两段序列分别代表从两个相反方向进行测序得到的结果。两者之间大约有1/2是重复的片断。最下方花黑框的位置就是初步的拼接结果。 4 - 用Contig Express进行手工校正 大家知道一般PCR测序结果总会有一些位置不明确或者被标记上“N”。这些“N”常出现的位置或者说测序最难测准的位置一般在测序引物的旁边也就是靠近边缘的位置。在序列拼接的过程中也会出现这样的情况。在重复片断内部，相同位置上两个反应的测序结果不同。这时我们根据经验，一般有疑问碱基若是出现在一个测序片断的中间部，那么它的准确性肯定强于相同碱基出现在测序片断两端的情况。 那么现在我们怎样方便的利用Contig Express寻找这些“N”呢？很简单。我们首先选定一个片断（比如下面的片断），然后点击下图中的---〉N图标。这时Contig Express就会为我们立刻找到有疑问的地方。比如下图中，相同位置同一碱基在两个测序反应中产生了不同的结果。一个是T，另一个是C。大家觉得我们该取那个值呢？当然是“C”，因为在这个位置上，下方的测序片断恰好位于中部，结果可信性高于上方位于头端的测序片断。我们可以手工将最下方Contig最终结果的“Y”更改为“C”。由此类推，不断地点击---〉N图标就能找到更多的“N”位点。最终我们可以将我们的Contig结果修改正确。 最后的步骤是得到最终Contig结果。我们用鼠标点击最下方的Contig 1行中的任意一个碱基。然后点击菜单栏上的Edit---Select All，下面的Contig 1行就会被全部选中。然后再点击菜单栏上的Edit---Copy Sequence From 1bp to 1750bp就可以把最终的Contig拼接结果拷贝到粘贴板上。接下来的步骤就不用我说了吧...... 1、核酸序列检索 可通过NCBI使用Entrez系统进行检索，也可用EBI的SRS服务器进行检索。在同时检索多条序列时，可通过罗逻辑关系式按照GenBank接受号进行批量检索。如用“AF113671 [ac] OR AF113672 [ac]”可同时检索这两条序列。其中“[ac]”是序列接受号的描述字段。 ? 2、核酸序列的基本分析 （1）分子质量、碱