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重组Rpastoris高密度培养和甲醇氧化酶活力研究 周长林’陈光明’赵明龙1林健1 E-mail：cl_zhou@cpu．edu．cm 1上海美通生物科技有限公司，上海200235) serum 人血清白蛋I!](human 链多肽，分子量约为68 KDa，是血浆中最丰富的蛋白质成分，约占血浆总蛋白的 60％。在体内人血清白蛋白可维持渗透压、递送重要生化物质和作为高容量储库稳 定体内游离配基的浓度，临床上广泛应用于大出血、休克、烧伤、成红白细胞增 多症和白蛋白过少症等。目前临床使用的人血清白蛋白均来自人源血浆，来源有 限，并且存在艾滋病、肝炎等病毒污染的潜在危险性。八十年代以来，人们通过 基因工程技术使HSA在细菌等宿主中得到表达，其中，毕赤酵母表达系统应用最 广。目前，制约rHSA应用于临床的关键是表达量和产品纯度。 1材料与方法 1．1材料 Phenyl．Sepharose和Sephacryl 为2％蛋白胨、0．1 提取物和4x10’5％生物素，诱导培养基用0．5％的甲醇替代发酵培养基中的甘油， 其它成份与发酵培养基相同。 1．2方法 1．2．1培养与表达斜面种子接种于摇瓶种子培养基，30℃、200r／re_in振荡培养16 h。摇瓶种子按10％的接种量接种至摇瓶发酵培养基，继续培养24h，发酵液于 5000 h，离心弃菌 诱导培养24h后补加5ml甲醇(终浓度为O．5％)，继续诱导培养24 体，含rHSA的发酵上清液于4C冰箱保存备用。 1．2．2 r／rain、4℃离心20min，沉淀用蒸馏水溶解、透析 度，静置过夜，12000 mmol／L磷酸盐缓冲液，样品调节至相应平衡缓冲液的 别为pH5．3和pH5．8的20 洗脱(O～0．5 均采用1 用O．85 S-200凝胶 水分别洗脱，收集rHSA活性峰，用蒸馏水透吸、冷冻干燥。Sephaeryl 过滤平衡缓冲液为30 rHSA样品于一30℃保存备用。 1．2．3蛋白纯度分析：12％SDS法。 通讯作者 131 2结果与讨论 2．1重组Ppastor括高密度培养、rHSA的诱导表达和甲醇氧化酶活力 在诱导表达时，控制好甲醇的补加速度是获得rHSA高效表达的关键。甲醇浓 度高，有利于维持菌体活性，增加菌体浓度，从而提高目的蛋白质的表达。然而， 10L发酵罐中试诱导实验表明，甲醇浓度应≤2ml／L，否则会抑制PAOXl的活力。 窖 詈 ≥ ￡ Culture Fig．1 curVeofrecombinantPpastoris 2．2rHSA的纯化 S．200凝胶过滤层析后所得的纯化rHSA 析、Phenyl．Sepharose疏水层析和Sephacryl 样品，经SDS．PAGE电泳检测为单一电泳条带(图5)。 rHSA等电点约为4．8，pH小于4．3时其不稳定，易被蛋白酶分解。离子交换 层断的pH范围为53～5．8，此时发酵上清液中色素含量高，且与蛋白相结合，直 接上阴离子交换柱会影响介质的分辨率、交换容量和介质的再生。在阴离子交换 层析之前，采用CM．Sepharose阳离子交换层析可有效地去除大量色素，并能除去 等电点小于5．3的杂蛋白。 offermentationbroth A：supematant