降落PCR法检测减蛋综合征病毒核酸地研究.pdfVIP

中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会成立20周年庆典暨第十次学术研讨会论文集 降落PCR法检测减蛋综合征病毒核酸的研究 张春杰，李银聚，程相朝，吴庭才，郑祥海 (河南科技大学动物科技学院，洛阳，471003) 减蛋综合征病毒(eggdropsyndrome 起蛋鸡产蛋量严重下降，产薄壳蛋或无壳蛋。该病在世界各主要家禽生产国中广泛流行，造成极大的经济 损失。 快速、准确地检测减蛋综合征病毒是有效控制该病的前提。对减蛋综合征的诊断，国内外已建立了多 缺点，而新兴的分子生物学技术聚合酶链反应(PCR)具有简便、快速、特异、敏感等特点，日前已被作 为一种主要手段而广泛应用于传染病的快速诊断。但应用降落PCR(Touchdown 测减蛋综合征病毒，在国内外还未曾见有报道。本研究应用所设计的一对引物，建立了特异、敏感、快速 检测EDSV的降落PCR法。 1_材料与方法 I．1试验用毒株 kg 存。 1．2主要酶与试剂 TaqDNA合成酶、dNTP 纯。 公司。 1．4病毒增殖 尿囊液，测其HA效价，一20℃保存备用。 1．5病料的采取 输卵管组织，剪碎、研磨，加适量PBS液制成悬液，经反复冻融三次后，离心取上清液以备抽提病毒核 酸o 1．6 EDSV—gDNA的提取 将尿囊液及组织上清液于422，5000 NaCI(2 淀物以100ul 蛋白分析仪定量。 中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会成立20周年庆典暨第十次学术研讨会论文集 1．7引物的设计与合成 PV 参考EDSVHI蛋自基因的核苷酸序列，设计了一对引物，上游序列为：5’一 大连宝生物工程公司合成，共扩增1．1kb左右片段。 1．8降落PCR法扩增PVI]I基因 ul、dNTPmixture2ul、10xBuffer 反应体系共50ul，上下引物各1 温度从66℃降至54℃。最后以72℃延伸10分钟。扩增产物经0．8％琼脂糖凝胶电泳分析。 1．9 PCR产物的鉴定 PCR产物克隆至PMDl8一T 切)和PCR鉴定。 I．10特异性试验 尿囊液作对照。 1．11敏感性检测 落PCR，以检测该方法的敏感性。 1．12人工感染鸡病料的检测 增。 2．结果 2．1降落PCR扩增 提物进行扩增。结果，均扩增出一条长约1．1kb左右的片段，与理论设计完全相符。 2．2重组质粒的酶切鉴定 重组质粒经EcoRI和Pst 异性片段。 2．3特异性试验结果 按照同样的条件和方法，对鸡痘病毒DNA和正常尿囊液进行PCR扩增，结果均未扩增出任何产物。 2．4敏感性检测 法可检出32pg的EDSV—gDNA。 3．讨论 中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会成立20周年庆典暨第十次学术研讨会论文集 目前，PCR技术已被作为检测病原体的一种重要手段而应用于畜禽传染病的检测诊断中。但应用降落 PCR法检测病原体的报道还比较少，尤其是应用于减胥综合征病毒的检测，迄今国内外还未曾见有报道。 本试验结果表明，应用所建立的降落PCR法可从减蛋综合征病毒基因组中成功的扩增出病毒的PvⅢ基 因，而该基因所编码的PVIII蛋自是腺病毒的主要结构蛋白，其对完整病毒粒子的形成是不可少的，且此 蛋白序列在EDSV中是比较保守的。因此，该降落PCR法可作为检测减蛋综合征病毒的特异性诊断法。 降落PCR技术是将多循环反应程序中的退火温度由起始的高于估计的Tm值随着循环的进行逐渐降低 到Tm值，并最终低于这个水平，从而确保第一个引物与模板杂交反应发生在最互补的反应物之间，即产 生目的扩增产物的反应物之间，由此大大提高了特异性目的产物的扩出率。在本研究进行的初期，我们试 出特异性目的片段。应甩该降落PCR法对此反应体系进行扩增时，即顺利的扩增出了目的片段。由此说 明，在对减蛋综合征病毒PvⅢ基因进行扩增时，降落PCR法要显著优于常规PCR法。 试验结果还显示，所建立的PCR法经对反应体系进行35个循环后，可检出32pg水平的病毒核酸， 如此微量的检出浓度，是其它诊断技术远远所不能及的。同时，该方法还可直接从