牛卵母细胞玻璃化冷冻保存影响因素的研究.pdfVIP

中陶备牧兽医’≯会动物繁殖学分会第1’四届学术研讨会论文集 牛卵母细胞玻璃化冷冻保存影响因素的研究 谭秀文。刘晓牧，游伟，黄金明，宋思亮。万发春 山东省农业科学院畜牧兽医研究所，山东省畜禽疾病防治与繁育重点实验室，济南250100 摘要本研究采用毛细玻璃管法对牛卵母细胞进行玻璃化冷冻保存，解冻后再进行体外受精(IVF)和早期胚胎的体外培养(IVc)。 在此技术的基础上，分别对冷冻前平衡时间、解冻处理、卵丘细胞层数以及卵母细胞所处的减数分裂阶段等影响卵母细胞冷冻保 乙二醇(EG)液(VSl)中平衡卜3min，然后进行玻璃化冷冻保存。解冻时将卵母细胞先移入VSl液中处理15s，然后移入蔗糖稀释液 中。另外发现，冷冻保存时部分卵丘细胞对卵母细胞有保护作用。而减数分裂阶段不影响解冻后卵母细胞形态正常率，但对胚胎 发育率有严重影响。 关键词卵母细胞，玻璃化冷冻，体外受精，牛 目前，家畜胚胎体外规模化生产、核移植研究和基因库的建立发展非常迅速，但所需的大量卵母细胞都来自屠宰 场中收集的卵巢。这就必然受季节变化导致卵母细胞质量改变和屠宰时间的限制，所以大大阻碍了研究T作的开 展。而卵母细胞冷冻保存技术，可以为胚胎的体外生产及相关生物技术的研究提供充足的材料来源；同时也是保存 品种资源的一种经济有效的手段。 研究者借鉴传统胚胎冷冻方法，首先在小鼠和仓鼠卵母细胞冷冻保存中获得成功Il】。十年后，利用同样方法冷冻 人卵母细胞，受孕者妊娠并产下婴儿【2J。但结果都表明卵母细胞冷冻保存效果远不及胚胎。家畜卵母细胞冷冻保存研 究进展较慢，冷冻后卵母细胞的受精率、卵裂率和囊胚率都较未冷冻卵母细胞低，迄今只在兔和牛获得来自冷冻成 熟卵母细胞的少数几个后代f3】。近年研究表明，玻璃化冷冻方法可以避免在细胞内形成冰晶，降低低温对细胞产生的 损伤，更适于卵母细胞冷冻保存。而牛卵母细胞对低温尤其敏感，发育到囊胚的比例仅为0％．10％M，而且试验结果 的重复性较差嘲。冈此，我们有必要深入探讨影响玻璃化冷冻保存卵母细胞的因素。为讲一步提高牛卵母细胞冷冻保 存效果提供理论基础和技术途径。 l材料与方法 1．1卵母细胞成熟培养 丘细胞后进行冷冻保存。试验中将卵母细胞体外分别培养0、4、8和15h后冷冻保存，解冻后移入成熟培养液中，分别 继续培养22、18、14和7h(总培养时J’日J约为22h)再进行体外受精。 1．2卵母细胞冷冻及解冻 将欲冷冻的卵母细胞先放在母液中，然后取2-4枚卵母细胞放在VSl中平衡一段时间，接着将卵母细胞连同尽量少 玻璃管)将卵母细胞吸入，立即投入液氮。(注：从卵母细胞放入vS2到装管投入液氮整个过程在25秒内完成。) 空气中停留3-4s，含液体的一端插入VSl中，在显微镜下观察到细管后用手指堵住细管的另一端，让卵母细胞流 5miIl，进行形态学评定。以解冻后卵丘细胞末脱落、透明带完整、胞质均匀的卵母细胞判为形态正常。选取形态正 常卵进行体外受精。 1．3体外受精及体外培养 头经过M测试的荷斯坦公牛)两管(co．G刚)投入39℃烧杯内水浴解冻，至冰晶消失后用干酒精棉擦干管擘水珠， 上清，再离心一次并去掉上清。缓慢加入O．5mL A液与B液(含20m∥mL 作者简介；谭秀文(J979．)，女，山东潍坊人，硕上．主要从事胚胎上程技术研究。E．m副l：lana@si船．湖 126． 中国齑牧兽医学会动物繁殖学分会第1‘四届学术研讨会论文集 mSoF缸液中洗三遍，然后放入20MLmsoF姐液滴中，每滴约10枚卵左右，隔天换半液，继续培养7—9天，在倒置显 微镜F观察并记录发育到2．细胞、4．细胞、8．细胞和囊胚的数目。 1．4统计分析 每组试验都重复3次以上。实验数据利用sPSs统计软件(SPSS 后进行单因素方差分析，P0．05为差异显著。 2结果 2．1冷冻前平衡时间对卵母细胞发育的影响 为研究冷冻前平衡时间对牛成熟卵母细胞玻璃化冷冻保存的影响，我们将部分脱卵丘细胞成熟卵在Vsl液中 min、lmin、3min、5 分别平衡0 min和10 组为未经冷冻的成熟卵母细胞。结果(表1)表明，平衡lmin和3mill组冷冻解冻后卵母细胞的形态正常率、2．细胞、