牛前脂肪细胞分离培养方法的改进.pdfVIP

巾【闾笛牧曾医学会动物繁殖学分会第十四肺学术研讨会论文集 牛前脂肪细胞分离培养方法的改进 藏坤啪，刘晓牧肇，宋恩亮柚。万发春犟，谭秀文站，潘庆杰1 l青岛农业大学动物生殖发育与基因1：程研究所，青岛266109；2山东省农业科学院畜牧兽医研究所，济南250loo： 3山东省畜禽疫病防治与繁育重点实验室，济南250100 摘姜通过观察显微镜下细胞形态、MTT法和油红0染色法检测结果，比较组织块培养法、传统消化法和改良消化法培养的牛前 脂肪细胞的差异。结果表踢三种方法均能培养出成熟脂肪细胞，细胞形态一致，其中改良消化法极大的缩短了试验样品处理妁时 间，且培养效率最高，细胞形态最好。表明改良消化法是一种长期有效的牛脂肪细胞培养方法，为进行牛脂肪细胞的相关研究提 供良好的技术平台。同时，本法对猪、羊等大型家畜前脂肪细胞的分离培养也有一定的借鉴作用． 关奠词脂肪细胞，细胞培养，牛 脂肪组织作为自分泌／内分泌器官，在调节能昌平衡中起重要作用，调控许多生理和病理过程【l】。从脂肪组织中 分离培养的细胞多称为”前脂肪细胞”。前脂肪细胞是一类具有增殖分化能力的脂肪细胞前体，在体内多种因素的 影响下聚脂分化而成为成熟脂肪细胞。通过体外培养牛前脂肪细胞，深入了解脂肪细胞的增殖分化规律，以期为调 控肉牛体脂沉积、预防奶牛围产期和泌乳高峰期疾病(酮病、脂肪肝)等提供新思路。 目前报道培养成功的前体脂肪细胞丰要来源于人、鼠、猪等闭。牛脂肪细胞培养在国外研究较早，Aso等在1995 对牛脂肪细胞展开了研究。牛原代脂肪细胞的培养方法主要有两种：组织块培养法和消化培养法【zJ。本研究基于传统 脂肪细胞培养方法，成功建立了牛皮下脂肪细胞体外培养的模型，并利用组织匀浆机处理脂肪组织，得到一种更为 方便、快捷、高效的脂肪细胞原代培养方法。 l材料和方法 1．1材料 12月龄鲁西黄牛f山东鑫源肉牛有限公司)禁食12一14h后屠宰，在无菌条件下切取皮下脂肪组织。 IU／rnL青、链霉素。基础分化培养液；在DMEM／F12培养基内加入lrnM辛酸钠、O。5％BSA以及lOU g／mL转铁蛋 白、17lJ M生物素、loo lJ U／mL青、链霉素。诱导分化培养 UM泛酸钙盐、10}j∥mL牛胰岛素、3g／mL胆固醇、loo mMIBMx、0．25MDEX。 液：基础分化培养液中添加0．5 Ij 1．2牛前脂肪细胞的原代培养 在无菌条件下将脂肪组织可见的血管和结缔组织去除后剪成9mm3左右的小块，分成三组，分别用于组织块培 养、传统消化法培养和改良消化法培养。 12l组织块培养 组织块继续剪成l衄3左右的小块，用吸管轻轻将组织块平铺于干燥的培养瓶底壁，然后将培养瓶翻转，向瓶 内加入适量DMEM／F12生长培养液，于C02培养箱(37℃，5％C02，饱和湿度)内培养，4h后翻转培养瓶，继续培 养。 1．22传统消化法培养 h，其间每5 组织块继续剪成lmm3左右的小块，加入3倍体积的0．1％胶原酶I溶液37℃消化1一1．5min振荡 m尼 1次。待组织块消化呈乳糜状，加入等体积的DMEM／F12生长培养液，中止消化。组织细胞液分别经孔径250 龙膜过滤于离心管内，800g，离心5min。弃上清，加入DMEM伊12生长培养液，吹打均匀，8009，离心5min，重复一 次后即得到牛前脂肪细胞。取牛前脂肪细胞悬液，用台盼篮染色法计数，按2，c104砌：n2密度接种细胞至25cm2培 养瓶和35mm培养皿，于C02培养箱(37℃，5％C02，饱和湿度)中培养。 l-2．3改良消化法培养 r／mill，待组织块呈 组织块移入匀浆玻璃管，固定到匀浆机支架上，打开电源，由低转速开始缓慢调节至180．200 乳糜状时停止匀浆。根据玻璃管内脂肪浆的体积加入3倍体积的0．1％胶原酶I溶液37℃消化30．40mirI，其间振荡 1—2