无选择标记转基因大豆表达载体的构建.pdfVIP

全国植物分子育种研讨会摘要集 无选择标记转基因大豆表达载体的构建· 黎明，欧秀元，魏东盛，张代文，邢来君，李明春” (南开大学生命科学学院) 转基因大豆是世界上转基因作物中推广时间最早、推广面积最大、效益最高的转基因作物。然 而，和所有其他转基因植物一样，构建的转基因大豆不仅含有目的基因，还含有选择标记基因，这 些选择标记基因可能对转基因植物和环境造成潜在的危害。因此，构建不含选择标记的转基因植物， 载体进行改造，构建一种可以在转基因大豆种子中表达各种目标产物、同时又不含有选择标记的转 基因大豆的表达载体pXB。 pX6．GFP载体上的组成型启动子GlO-90，就将pX6埘P载体改造成新的p952-GFP载体。 将pX6啦P和p952-GFP载体采用根瘤脓杆菌介导的子叶节转化法转化大豆，分别提取转化苗 茎和叶的基因组，用PCR的方法确认目的载体片断是否插入转化苗的基因组中。然后将含有pX6-GFP 和p952-GFP载体片断的转化苗各分成两组，一组用5Ⅲ几13一雌二醇诱导，一组不进行诱导，再 分别提取转化植株的茎、叶和种子的基因组，通过PCR的方法确定两个loxP位点之间的选择性标 记以及Cre、XVE序列是否从大豆基因组中切除；同时做转化植株的茎、叶和种子的组织切片，在 荧光显微镜下观察报告基因GFP是否表达。结果表明，pX6一GFP载体转化植株中，经过B一雌二醇 诱导植株的茎、叶和种子基因组中的两个loxP位点之间的选择性标记及其他序列被切除，他们的 组织切片中也有较强的荧光，说明GFP已经表达，而没有诱导植株的茎、叶和种子基因组中的两个 loxP位点之间的选择性标记及其他序列也有被切除现象，茎、叶和种子组织切片中也有微弱的荧 间的选择性标记以及其他序列被切除，也只有种子组织切片中有较强的荧光，说明GFP只在种子 中表达，而其他组织以及没有诱导植株的所测组织的基因组中的两个loxP位点之间的选择性标记 以及其他序列都没有被切除，也没有GFP表达。这些结果告诉我们：①大豆体内本身有微弱的雌性 激素表达，可诱导将转化植株基因组中pX6-GFP载体上两个loxP位点之间的选择性标记以及其他 序列切除；②用pX6_GFP载体可构建无选择标记的转基因大豆，在茎、叶和种子中同时表达外源目 的基因，但由于缺乏种子专一性，对通过收获种子而获得目的基因产物来说，这样是一种极大的浪 费。③用p952-GFP载体也可以构建无选择标记的转基因大豆，而且外源目的基因只在种子中特异 性表达，也就是说，只要将GFP基因改成外源目的基因，就可以直接在种子中收获目的基因产物了。 二、无选择标记转基因大豆表达载体pXB的构建：由于p952一GFP载体的GFP基因位置没有特 异性的酶切位点，用外源目的基因直接取代GFP基因十分麻烦。设计特异性引物，用多克隆位点取 克隆位点，构建无选择标记的转基因大豆，并且在种子收获目的基因产物。 Constructionof VectorfortheProductionofSelectable Expression Marker．free TransgenicSoybeans (20070055061) 139