大黄酸调控mTOR信号通路活性抑制肾小管上皮细胞自噬蛋白表达的分子机制.docVIP

大黄酸调控mTOR信号通路活性抑制肾小管上皮细胞自噬蛋白表达的分子机制 　　[摘要] 目的：探讨大黄酸抑制饥饿诱导的肾小管上皮（NRK-52E）细胞自噬蛋白的作用和分子机制。方法：用Hank′s平衡盐溶液（Hank′s balanced salt solution，HBSS）诱导NRK-52E细胞产生饥饿状态，在干预后的各时间点（0，0.5，1，2，6 h），首先，检测细胞自噬标志性蛋白――哺乳动物同族物微管相关蛋白1轻链3（microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3）I/II的表达水平；其次，检测细胞哺乳动物类雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）表达及其磷酸化水平（phosphorylated-mTOR Ser2448，p-mTOR S2448）；然后，以大黄酸（5 mg?L-1）、HBSS（1 mL）以及mTOR抑制剂雷帕霉素（100 nmol?L-1）单独或联合干预，分别检测其LC3 I/II，mTOR，p-mTOR S2448蛋白表达水平的变化。结果：HBSS诱导NRK-52E细胞LC3 II蛋白高表达、p-mTOR S2448蛋白低表达；大黄酸与HBSS联合干预可以逆转HBSS诱导的NRK-52E细胞LC3 II和p-mTOR S2448蛋白表达水平；雷帕霉素与大黄酸、HBSS联合干预可以恢复HBSS诱导的NRK-52E细胞LC3 II蛋白表达水平。结论：HBSS抑制mTOR信号通路活性而诱导肾小管上皮细胞发生自噬；大黄酸调控mTOR信号通路活性而抑制肾小管上皮细胞自噬蛋白的表达，这可能就是其干预细胞自噬的作用和分子机制。 　　[关键词] 大黄酸；自噬；mTOR信号通路；肾小管上皮细胞；雷帕霉素 　　自噬（autophagy）是真核细胞内一种溶酶体依赖性蛋白降解过程，主要分为巨自噬（macroautophagy）、微自噬（microautophagy）和分子伴侣介导性自噬（chaperon-mediated autophagy，CMA），其中，巨自噬（简称为自噬）在细胞内最为普遍[1]。研究表明[2-3]，自噬在饥饿、缺氧、缺血/再灌注和感染等条件下可被激活，并且，在维持细胞内环境稳定、调控能量代谢等方面发挥着重要作用。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）可以调控细胞周期及其增殖和凋亡过程，同时，作为自噬的主要调节剂，它能够抑制细胞自噬[4]。然而，对于肾小管上皮细胞而言，在生理和病理条件下，自噬对其作用究竟是怎样的？是否可以被临床上常用的“保肾”中药或雷帕霉素所影响？目前还不是很明确[5]。 　　据报道[6]，自噬与凋亡之间有着密切的联系。借助腺嘌呤诱导的肾间质纤维化模型鼠，笔者发现，大黄附子汤（由大黄、附子、细辛组成）可以通过调控JNK/Bcl-2信号通路而改善模型鼠肾小管上皮细胞凋亡和肾间质纤维化[7]。作为大黄附子汤君药之一的大黄，其主要成分――大黄酸（rhein）在体内外可以调节肾小管上皮细胞转分化，改善肾纤维化[8-9]，那么，大黄酸是否在体外可以影响肾小管上皮细胞自噬，并通过mTOR信号通路而发挥调节作用呢？笔者采用Hank′s 平衡盐溶液（Hank′s balanced salt solution，HBSS）诱导大鼠肾小管上皮（NRK-52E）细胞饥饿状态而激活其自噬，与雷帕霉素相对照，试图阐明大黄酸通过mTOR信号通路干预NRK-52E细胞自噬的作用和分子机制。 　　1 材料与方法 　　1.1 药物与试剂 大黄酸（用0.1 mol?L-1NaOH配置成1 g?L-1溶液）、雷帕霉素（用二甲基亚砜配置成100 μmol?L-1溶液）购自美国Sigma-Aldrich公司；Dulbecco′s Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12（DMEM/F12）培养基、胎牛血清（Fetal bovine serum，FBS）、青霉素链霉素溶液、Hank′s 平衡盐溶液（HBSS）购自美国HyClone公司；溴酚蓝（bromophenol blue，BPB）、二硫苏糖醇（dithiothreitol，DTT）和BSA（bovine serum albumin）购自BioSharp公司；磷酸酶抑制剂（phosphatase inhibitor cocktail）和Chemi-Lumi One L发光液购自日本Nacalai公司；蛋白酶抑制剂、显影定影试剂盒购自碧云天公司；蛋白相对分子质量Marker购自美国Thermo Scientific公司；聚偏二氟乙烯（polyvinylidene flu