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2014年第1期 O高校讲坛0科技信息 微生物染色实验 张娴 (同济大学环境科学与工程国家实验教学示范中心，中国上海200092) 【摘要】以大肠杆菌和枯草芽孢杆茵纯茵作为实验材料，在环境专业本科生中开展细菌简单染色和革兰氏染色实验，巩固了学生专业基 础理论知识，锻炼了学生实验操作技能，促进了学生创新能力的培养。 【关键词】微生物；染色；实验 0引言 用的有压滴法、悬滴法和固定等。本实验主要采用涂片与干燥的方法 制片进行观察。 在环境微生物学实验课程中．细菌的简单染色和革兰氏染色是非 革兰氏染色有很多步骤．在这些步骤中．涂片质量的好坏直接影 常重要的一个实验旧。由于细菌个体小，人们难以用肉眼观察，需要借 响最后显微镜观察的效果．所以涂片是比较重要的步骤。需要学生额 助显微镜才能看清其个体形态。加上一般情况下。细菌是无色透明的。 外多一些细心与耐心。在涂片前，先取一块干净的载玻片，在载玻片中 用显微镜观察时．细菌和显微镜背景之间反差小．不易看清细菌的形 央滴一滴无菌蒸馏水．然后学生点燃煤气灯．把接种环的前端放到火 态。因此。为了增加细菌和显微镜背景之间的色差。便于在显微镜下看 焰上灼烧一会进行灭菌．等接种环冷却后用接种环从细菌斜面中挑取 清楚细菌的形态。人们发明了微生物染色方法。 少量菌体在载玻片水滴上均匀地来回打圈．将细菌和水充分混合．面 1染色原理 积大概和人的小拇指指甲一半大小，最终涂布成一均匀的薄层。很多 学生涂成薄层以后，能够看到薄层呈现淡淡的白色。在这里，需要说明 蛋白质、核酸等是构成细菌茵体的重要化学物质。蛋白质、核酸都 的是．学生从斜面中挑取细菌的过程中。在取下斜面试管口的棉塞以 是两性电解质。蛋白质由氨基酸组成，氨基酸带有羧基和氨基，在发生 后，试管口要快速过火。挑取细菌以后，试管口要再次过火，然后再塞 解离后。羧基和氨基会分别带有负电荷和正电荷。在碱性条件下，带正 上棉花塞。这些实验操作动作要快。以防止斜面里的纯菌被污染圈。 电荷的氨基解离出氢离子，和溶液中的羟基结合生成水。氨基酸中羧 涂片做好后．要进行干燥将细菌菌体固定．这样才方便显微镜观 基带负电，所以整体表现带负电荷；相反地，在酸性条件下，带负电荷 察。干燥过程中可以将涂片放在空气中自然干燥．也可以将载玻片在 的羧基与溶液中的氢离子结合．氨基酸中只有氨基带正电荷，所以整 微小火焰上方多次来回水平移动，让涂片均匀受热。将涂片缓慢烘干。 体表现出带正电荷。当溶液的pH值恰好是氨基酸的等电点时，此时， 有的学生比较心急，想快一点烘干涂片，所以将火焰调地比较大。如果 氨基酸所带的正电荷和负电荷相等．由于电荷相反。所以氨基酸整体 加热温度过高的话，涂片受热不均匀．很可能会使细菌细胞变性、甚至 表现出带电荷为零的状态。由于细菌的等电点一般在2—5之间，而在 碳化，影响观察。 通常条件下，细菌存在的环境一般为中性、碱性或者偏酸性。其pH值 涂片固定以后，进行初染。在涂片上滴加草酸铵结晶紫染液染色 大于细菌等电点。这种情况与细菌处于碱性环境中比较类似，所以在 1—2分钟，将涂片倾斜着放到水龙头下，让小股水流轻轻流过涂片，直 此条件下细菌整体表现出带负电荷。针对细菌的这个特点．在对细菌 到流下的水无色为止。然后用吸水纸将涂片周围水分吸干净。 的染色过程中．使用带正电荷的碱性染料更容易与细菌结合．如亚甲 初染以后进行媒染，在涂片上滴加革兰氏碘液，染l一2分钟，然后 蓝、甲基紫、结晶紫等，所以微生物染色多用碱性染料四。