不同变性剂对大肠杆菌碱性磷酸酶构像影响地研究.pdfVIP

分析化学的成就与挑战 不同变性剂对大肠杆菌碱性磷酸酶构像影晌的研究 张海容 陈金娥李满秀 (山西省忻州师范学院化学系忻州034000) 关键词大肠杆菌碱性磷酸酶室温磷光构像变化 普遍认为蛋白质的变性作用是由于破坏了维持其折叠态的作用力．即范德华力、静电 引力、氢键以及不同氨基酸和辅基之间的共价键力卟”。因此，使f{j变性剂来破坏这种作_L}j 力对研究蛋白质的每种具体构像变化及展开程度是～种直接、行之有效的方法。本文的研 究工作是在不同变性剂存在下，通过大肠杆菌碱性磷酸酶在展开过程中磷光性质的变化， 对AP的结构、色氨酸所处的微环境及猝灭动力学性质作了初步探讨。 1实验部分(略) 2结果与讨论 2．1AP的RTP光谱 由实验知，AP在Tris．HCI缓冲液和不同变性条件下，激发、发射峰侍置基本保持不变， moVLEDTA厉， nm。在4mol／L盐酸胍存在下，或加入1．15×104 丑、=284am，九产445 性剂，AP逐渐处于展开态．原来处于“剐”性环境中的色氩酸残基移到展开态的表面，磷 光强度下降。 2．2pH对APRTP强度的影响 当pH4时，平衡遭破坏，发磷光的Trp．109暴露在蛋白质的表面，RTP全部熄灭。 rain)酸变性作用，转变中心移至口H=5．5左右，表明AP在酸中的变性 经过较长时间(t=330 途径较复杂。 2．3盐酸胍的变性作用 与酸类似，胍是蛋白质极普遍的变性 剂。加入盐酸胍后不同时问对AP的变性 120 作用见图l。加入Gdn．HCI后，RTP强度 rlFl01／L～2tool几 在变性齐tJ[Gdn．HCll约1．5 时，发生较大的转变：当盐酸胍浓度在 B0 2m01／L～3 mol／L时，RTP强度缓慢下降， 这可能与中间稳定态形成有关：当 t 一 mol／L时，已无法检测RTP fGdn．HCI]4 40 信号，说明AP已完全处于展开态。放置 不同时间溯得RTP强度随Gdn．HCl浓度 增加而下降呈现平行关系。通过测定AP O 的RTP寿命与Gdn-HC]浓度变化发现， 加入变性剂盐酸胍后0,5h，随Gdn．HCI 一1 0 1 2 3 4 浓度增加，寿命几乎是一个常数：放置 molJdm‘3 [Gdn．HCll 72h后重复测定AP浓度变化，盐酸胍浓 mollL～2．5mol／L 度寿命随Gdn-Hcl在0 h时情况相比，无任何 范围内，与t=O．5 tool／L时， 图1旅置时间及Gdn．HOI浓度对AP磷光强度的影 显著变化，只有[Gdn·HCll2,5 寿命降低为520ms左右。 1398 分析化学的成就与挑战 2．4EDT^变性作用 极少量的EDTA加入，导致RTP强度大大降低。AP是一种金属酶，每个二聚体含4 个锌原子和2个镁原子，锌在AP的磷光色氨酸附近维持结构刚性化。EDTA加入后，与锌 或镁发生竞争性配合作用，导致锌离子严重损失，刚性化降低，磷光减弱，磷光寿命缩短。 3结论 本文通过各种变性剂对AP的RTP强度、寿命影响测定表明在pH4或盐酸胍浓度犬 于l，5mol／L以及极少量螯合