超微量乳酸脱氢酶毛细管电泳在线反应电化学检测地研究.pdfVIP

—— 坌堑些兰塑堕塾量垫些—～ 超微量乳酸脱氢酶毛细管电泳在线反应电化学检测的研究+ 俞爱民 杨丈初 陈洪渊 (南京大学化学化工学院分析科学研究所南京210093) 关键词毛细管电泳电化学检测乳酸脱氢酶 自80年代末期以来，高效毛细管电泳(HPCE)-在生命科学研究领域的应州日趣广泛。在酶活 性分析方面，Regnier研究小组的工作很具创意。他们首次提出了酶的毛细管屯泳均相在线分析技 Mediated 术【1l’并随后被称之为“电泳中介微分析”(Electropho商Se 该技术把反应、分离、检测集于毛细管内一次完成，操作简便、快速．结台特殊的技术，可获得 极高的检测灵敏度。在其后短短几年的时间内，该技术受到广泛关注，并得以迅速发展H朋。该 技术使用的检测方法绝大多数为紫外阿见(UV～is)或激光诱导荧光(LIF)检测方法。然而，UVFvis 检测灵敏度低，LIF的检测灵敏度虽高，但其价格高昂。电化学检测(EC)不仅价格低廉而且 对电活性物质检测灵敏度可接近甚至超过L1F检测。本文利用EMMA技术，以LDH催化JL{L 酸和NAD+反应生成丙酮酸和NADH为基础，研究了超微量LDH的毛细管屯泳在线反应EC 检测方法，并首次导出了该平台宽度和高度的理论表达式。 1EMMA基本原理111 EMMA有恒高压和零高压两种操作模式。恒高压模式：在屯渗流(EOF)的作用下含酶反应 底物的电泳介质在毛细管内迁移。酶试液进样后，在迁移的同时持续发生下述快速反应： ES；；====当P+E。 S+E；；==—兰一 假定ES、P具有不同的荷，质比，在自由区带电泳时，它们就会有不同的电泳淌度。若ES 的淌度(胜s)小于P的淌度(帅)，则P的电泳区带在前，Es的电泳区带紧挨其后。电泳反应 过程中，因P生成后即电泳离开Es区带，且其区带不断加宽，故尽管P的总量不断增加．其浓 度却保持不变，且在区带内近似呈均匀分布。假定S、E均无响应信号，且E在柱内无吸附。则 P的电泳响应出现平台。酶的活性越大，生成产物越多，平台越高，由此构成了EMMA定量的 基础。EMMA零高压模式是在酶电泳一段时间后，P流出前切断高压，让酶在柱内温育一段时 间再恢复高压。这样在电泳区带不明显扩散的温育时间内会有更多的产物生成．从而显著提高酶 的检测灵敏度。 2NADH的HPCE，EC 在LDH催化L．乳酸和NAD+的反应体系中，生成的NADH是目标检测物，故首先对NADH V。对NADH的检测 溴化十六烷基吡啶(CPB)；电场强度，一O．4kV／em；检测电位．+0．8 7。 的浓度呈线性关系，其回归方程为：y=6．8z+0．03．，=0．999 3LDH的EI州-A 图1A(略)为恒高压模式下LDH的EMMA电泳图。该图与理论预测基本一致，但并非完 全平台。这是产物区带仍存在一定扩散所致。实验结果表明，LDH活性的检测限为1．1×10一U。 +国家自然科学基金和长春应用化学研究所电化学开放实验室资助项目。 1024 ————一 坌堑些兰竺些些量垫些 图IB(略)为EMMA的零高压条件的电泳图。该图相当于图1A的平台上叠加一个因反应产物 积累而造成的小峰a该峰的高度与停高压后温育的时间有关。在一定H{间内，温育时间越K．峰 越高。但过分的温育不仅会延长分析时间，也会导致峰的加宽．有碍灵敏度的提高。在本文条件 10-10U。 下得到LDH活性的检测限为6．0x 4EMMA中平台宽度和高度的理论探讨及其意义 当#虹‘坤，并忽略组分的扩散和酶在柱内的吸附时，根据EMMA的原理．我们导出平台 宽度的表达式为： 肚量‘万乏’ (1) 平台高度(用峰电流f表示)的表达式：