糖蛋白的糖形分析及糖和蛋白质相互作用的微流控芯片研究.pdfVIP

中国资源生物技术与糖工程学术研讨会论文集2·005 糖蛋白的糖形分析及糖与蛋白质相互作用的微流控芯片研究 梁爱叶毛秀丽刘晓君盖宏伟 林炳承 (中国科学院大连化学物理研究所) 微流控芯片实验室又称芯片实验室 (Lab-on-A-Chip)或微流控芯片 (Microfluidic)，指把生物和化学等领域中所涉及的样品制备、反应、分离、检测等基 本操作单元集成或基本集成到一块几平方厘米(甚至更小)的芯片上，由微通道形成网 络，以可控流体贯穿整个系统，用以取代常规生物或化学实验室的各种功能的一种技术。 微流控芯片实验室的基本特征和最大优势是多种单元技术在微小平台上的灵活组合和 大规模集成。 微流控芯片实验室以微流控技术为基础，它有别于另一类以静态亲和杂交技术为 核心的微孔板芯片，后者通常被称为 “生物芯片”，以蛋白质芯片为典型代表。在一段 时期的学术刊物中。微全分析系统中-TAS)往往和微流控芯片实验室混用。事实上， 较之微全分析系统。微流控芯片实验室的外延更宽，内涵更为丰富。微流控芯片实验室 的最早期形式是芯片毛细管电泳，芯片毛细管电泳至今仍是芯片实验室中分离部分的主 体。 本工作利用微流控芯片和毛细管电泳 (CE)进行糖蛋白的糖形分析，并对糖与蛋 白质相互作用做了较系统的研究。 在糖蛋白的糖形分析方面，建立了微流控芯片/外切糖普酶酶解进行糖蛋白中糖链 结构分析的方法;对不同物种中的同类糖蛋白中的糖链结构进行了比较。在集成化的微 流控芯片上实现了凝集素亲和层析。构建豌豆凝集素亲和微流控芯片，含有不同类型搪 链结构的三种糖蛋白(鸡卵白蛋白、火鸡卵白蛋白和卵类粘蛋白)的糖形因和豌豆凝集 素具有不同亲和力而得到分离。将凝集素亲和层析所需要的时间减少到3%,，即从4小 时减少到400秒，只需要300pg的糖蛋白就可以完成整个分析过程。凝集素亲和层析的 操作过程也大为简化。 在糖与蛋白质相互作用方面，利用CE,微流控芯片和单分子荧光成像从分子水平 到单分子、单细胞水平研究了粒细胞集落刺激因子 (G-CSF)与硫酸多糖的相互作用。 在分子水平上，利用CE系统研究了G-CSF和3类 (肝素、硫酸葡聚糖和卡拉胶， 共15种)硫酸多糖的相互作用，发现其中10种能和G-CSF结合，并求得了结合常数。 结果表明，这些硫酸多搪和G-CSF结合的强弱与硫酸多糖的链长、硫酸化程度以及硫酸 化位点有关。利用微流控芯片做了进一步研究，所得结果与CE一致。利用单分子荧光 成像，发现隐失场中分子个数随分子量的增大而减少。据此提出了一种无需分离而鉴定 分子相互作用的新方法。因相互作用而结合的分子复合物的分子量大于相互作用前分子 的分子量，隐失场中检测到的分子复合物的分子个数应小于分子反应物的分子个数。以 肝素和G-CSF的相互作用验证了这一方法的可靠性。 在上述研究的基础上，在细胞水平上利用G-CSF结合多搪刺激G-CSF依赖细胞株， NFS-60.并利用MTT,Wright-Giemsa染色和流式细胞仪研究了细胞的增值、分化和细 胞周期变化。发现在这些硫酸多糖中，有抗凝活性的低分子量肝素、硫酸葡聚糖、入卡 拉胶能显著抑制NFS-60细胞的生长并诱导其分化为成熟细胞，而壳寡糖能促进此细胞 中国资源生物技术与据工程学术研讨会论文集2·005 的生长。本研究对硫酸多糖结构一功能的关系以及其在白血病治疗中的潜在应用价值有 重要意义。 致谢:感谢山东齐香制药厂提供研究所用样品;大连医科大学和大连医科大学附属第二医院提供使用 显微镜和流式细胞仪:中科院大连化物所马小军课题组在细胞培养方面所给予的帮助。