DN-TNFα及二硫键缺失的生物学活性研究和对大鼠关节炎治疗的探讨.pdfVIP

DN．TNFot及二硫键缺失的生物学活性研究和 对大鼠关节炎治疗的探讨 陈程，楼觉人 (上海生物制品研究所研发部．上海200052) 摘要：目的对DN-俐№的生物学活性以及二硫键在TNYct中的作用进行了研究，并探讨了DN-悄h对CIA大 鼠关节炎的治疗效果。方法用重叠延伸PCR法对TNh引人点突变，以pET-28a为载体构建了Native悄№、二 colt BL-2I，IPTG诱导蛋白 硫键缺失TNFa(C69L、C69S)和DN-TNFa(A145R／Y87H)四种蛋白的重组质粒，转化E blot进行鉴定 表达，表达产物经离子交换柱层析(CM柱／DEAE柱)进行分离纯化，并通过SDS—PAGE和Western 得到四种目的蛋白。对NativeTN凡和突变TN耻四种蛋白进行了细胞毒性、细胞凋亡和NF-KB信号传导一系列 物学活性的影响，以及DN．TNFCt的生物学功能和对大鼠CIA的治疗效果。结果二硫键缺失1研h在细胞杀伤以 及诱导NFKB信号传导方面与NativeTN№的生物学活性相当，但DN—TN№的细胞毒性和NFKB信号传导都表现 出极低的生物学活性。在大鼠CIA关节炎发病的起始阶段，DN-TNn通过抑制TN趾的生物活性，阻断其下游信 号传导，有效地控制了关节炎发生发展，但在症状稳定期其治疗效果并不明显。结论二硫键并不是维持TNh结 构和功能的关键因素，可以利用讯№的巯基进行PEG化学修饰；DN·TNFa具有极低的生物学活性，在体内能够抑 制NativeTNn的话性，缓解初期关节炎的发生发展，具有成为一种新型的以TNFa为靶向的抗炎症治疗药物的 潜力。 关键词：1)c,minam—NegativeTNFa(DN-TNFa)；风湿性关节炎(RA)；幕乙二醇(PEG) NecrosisFactor 肿瘤坏死因子(Tumor alpha， TNFa保持了完整的TNFet空间结构，可以形成低活 TNFct TN风)是一种多效生物活性的细胞因子，能够介导 性或无活性的三聚体结构，并且能够与Native 多种不同的生理反应，包括细胞凋亡，细胞增殖，分 同源三聚体中的单体进行竞争性交换，形成异源三 化．炎症反应和免疫应答…。TNFct在很多类型的聚体。异源三聚体的活性显著降低，能够有效阻断 下游信号的传导，抑制TNFct的活性，使其无法行使 细胞中均有表达，其17kDa可溶性单体是由26kDa 的Ⅱ型跨膜TNF前体蛋白通过蛋白酶切形成的。 生物学功能”1。 TNFot形成51kDa同源三聚体后能够与TNF受体结 材料与方法 合，引起下游信号传导，发挥其生物学功能”。3’。 1 质粒、菌株及细胞 TNFct在类风湿性关节炎(RheumatoidArthritis，RA) colt 质粒pET-28a，TNFa重组表达质粒，E 的致病机制中起关键作用，在炎症性肠病，强直性脊 TOPl0感受态细胞．HEK293T细胞株为上海生物 髓炎，银屑病等自身免疫性疾病中，都有TNFet表达 19一T Vector购