Reversine对成纤维细胞去分化能力影响.pdfVIP

2012，VOLUMEl3，NO．1ANIMALBIOTECHNOLOGYBULLETIN 155 Reversine对成纤维细胞去分化能力的影响 姚雅馨“2，李向臣1，李和平2，关伟军1’，马月辉卜 (1．中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，北京，100193； 2．东北林业大学，黑龙江省哈尔滨市，150040) 引言 由于诱导性多能干细胞(iPS)可作为胚胎干细胞最好的替代品用于科学研究 和临床治疗，是近年来干细胞研究的热点领域，然而，目前人们对iPS细胞的诱导 效率和安全性的怀疑成为其发展的瓶颈，因此，人们把目光集中在小分子化合物 对分化体细胞的去分化研究上，期望寻找到一种安全有效获得的去分化细胞的方 法。Reversine是一种小化合物，利用它处理成体细胞后能够明显将其转变为一种 与干细胞类似的“原始状态”，例如，利用reversine预处理小鼠的骨骼肌细胞， 可使其去分化为某些前体的细胞，通过后期诱导可定向分化成为成骨细胞或脂肪 细胞。但是，reversine还未应用在除小鼠和人的其他体细胞上，特别是畜禽体细 胞上。 材料方法 本研究利用牛复苏后的成纤维细胞作为研究材料，利用5HM的reversine预处理 4d，在显微镜下观察处理前后的细胞形态变化，利用PI染色法，通过流式细胞仪 检测处理前后细胞周期分布情况，并利用AnnexinV／PI双染法检测细胞凋亡现 Cruz 象：利用间接免疫荧光法，通过抗体antbBrdU(1：200，SantaB Santa Cruz,CA, USA Phallotoxins(1：40，i n-eTubulin(1：200，ingoi， )和微丝抗体tiv_nvitrogen， USA)检测细胞骨架的变化情况：为检测组蛋白修饰水平，本研究利用的抗体 10 Cruz anti。acH3K9，anti．meH3K9和anti．P．H3Sf1：200，SantaBiotechnol02v。Santa 处理前后的细胞分别向代表中胚层的成骨和成脂细胞方向、代表内胚层的肝样细 胞方向和代表外胚层的神经元细胞定向诱导分化，并利用免疫细胞化学法染色和 RT-PCR鉴定诱导是否成功。 结果 Reversine是通过抑制细胞的正常分裂，而积蓄能量形成具有全能性细胞特性 的多核细胞获得去分化能力的，处理后成纤维细胞呈典型的四倍体特征，流式细 胞仪检测后发现G2／M期的细胞占80％以上，细胞凋亡现象不明显：检测细胞增殖 能力后发现，代表正增殖细胞的BrdU的荧光水平明显降低，说明细胞增殖能力受 到抑制：利用共聚焦的定性和流式细胞仪定量检测后发现，经过reversine处理后 的成纤维细胞乙酰化水平明显升高，而甲基化和磷酸化水平均有一定程度的降 低，这在一定程度上证明了reversine能够通过表观遗传修饰的重编程过程使成纤 维细胞获得了去分化的能力；将成骨诱导后的细胞经茜素红染色后，所形成的钙 结节呈