CR-SSCP与PCR-RFLP技术对猪食道口线虫的分子鉴定研究.pdfVIP

兽医部分 785 参考文献 [1]江鹏斐，谢庆阁，口蹄疫病毒非结构蛋白区分感染动物和注苗动物．中国兽医科技：1999．29(12)：47．48 [2]柳纪省，口蹄疫研究进展．中国兽医科技，1999．29(3)：17～22 [3]F．奥斯伯，R．布伦特，R．E．金斯顿．精编分子生物学实验指南[M]．=lE京：科学出版社，1998，652。658 Grubman 【4j MJ，Robertson DO，eta1．Biochemicalof foot—and—mouthdis． BH，Morgan mappolypeptidesspecifiedby easevirus．J．Virol，1984．50：579～586 [5]KnowlesNJ，SamuelAR．Molecular offoot—and—mouthdisease epidemiology virus．Virus,2003．91：65～80 线虫的分子鉴定研究+ 。 林瑞庆1，张新高2，魏冬霞1，邓艳1，吴绍强1，宋慧群1，朱兴全1 1．华南农业大学兽医学院，广州，广东，510642；2．深圳市南山区动物防疫监督所，深圳，广东，518051 摘要：以采自我国不同地区猪体的食道口线虫虫株为研究对象，PCR扩增出ITS一1和ITS一2序列片段，然后 采用单链构象多态性(SSCP)方法分析PCR产物，对不同地区食道口线虫进行分子鉴定。所有样品经SSCP分析和测 序证明为两个种：有齿食道口线虫和四棘食道口线虫。在此基础上，PCR扩增rDNA转录间隔区(ITS)片段并纯化，选 进行分子鉴定。本研究在国际上首次报道了中国猪四棘食道口线虫的ITSl和ITS2序列，并建立了区分有齿食道口线 奠定了基础。 关键词：有齿食道口线虫；四棘食道口线虫；ITS；Pstl；PCR—SSCP；PCR—RFLP 肠道所引起的；通常发生予偶蹄动物、猪和猴子，但也有感染人的报道，而且在非洲的一些地区，感染率 高，甚至形成地方性流行。因此，对食道口线虫的研究，除对畜牧业生产有重要意义外，也具有重要的 公共卫生意义。国外已将猪的食道口线虫感染用作研究人体食道曰线虫病的动物模型。国内调查表 dentatum)和长尾食道1：1线虫 明，感染猪的食道口线虫主要是有齿食道口线虫(Oesophagostomum (Oesophagostomum 鉴定的报道，大大地促进了食道口线虫分类学的研究。在国内外的一些研究中，核糖体DNA(rDNA)， 尤其是内转录间隔区(ITS)作为保守的结构序列，被认为是发展敏感、特异的检测系统的理想靶物[2 —5]。有鉴于此，本研究以从国内不同地区猪体分离的食道口线虫为研究对象，PCR扩增其ITS片 段，建立了准确的、特异的PCR—SSCP和PCR—RFLP分子鉴定方法。 1材料和方法 1．1 虫体样品 虫体样品来自中国广东阳江，重庆及湖南望城、平江、宁乡、长沙及岳阳，宿主为猪，经形态学初步 -基金项目：国家杰出青年基金项目；救甯部优秀胬年教烯黉璐诗辫疆露，繁崧念为潦撩傣囊。 786 2005学术年会 鉴定为食道口线虫，70％酒精保存(表1)。 1．2主要试剂 蛋白酶K为Merck公司产品；DNA提取试剂盒WizardTMDNA Clean—Up 司产品；PCR试剂(Ex MDE)岷]yBioWhittakerM。lecular Applications公司产品；7FEMED为Sigma 式PCR产物纯化试剂盒为生工生物工程(上海)有限公司产品。 1．3虫体DNA提取 取单个成虫，用SDS裂解缓冲液和蛋白酶K在37。C消化12～48h。消化好的虫体悬液按 DNA Promega试剂盒WizardTMClean—up 存备用。 表1食遵口线