第四节黑鲷细菌性疾病的病原的研究.pdfVIP

352 第七章 海洋生物的疾病防治技术 第四节 黑鲷细菌性疾病的病原研究 macrocephalus)俗称铜盆、青郎，属鲈形目、鲷科、鲷属，是一种肉味鲜美的暖 黑鲷(Sparus 温性底层鱼类，分稚在我国和朝鲜、日本沿海内湾，因其适温、适盐性广，食性杂、生长快，苗种 来源广，养殖成活率高，产品畅销，经济价值高，是一种适合于集约化养殖的海水品种之一。在 我国的广东、福建两省在20世纪80年代已开始网箱养殖，在浙江的沿海地区主要始于90年 代，现已规模化养殖，并在黑鲷的繁殖生物学、养殖、人工放流等方面进行了研究¨．2J。有关黑 鲷的细菌性病原的研究未见报道。本文主要针对养殖阶段中经常发生的腐皮病进行研究，着 重对细菌的分离、鉴定、致病性等作一报道，以期提高对该病的认识，并为该病的防治提供参考 依据。 一、材料与方法 (一)材料来源 发病的黑鲷来自浙江象山湾奉化某网箱养殖场的鱼种；健康黑鲷购于另一养殖场，体重为 30～409，在室内暂养7d后进行试验。 (二)病原分离及寄生虫观察 从患病黑鲷的肝、肾等组织取样进行琼脂平板划线分离。所用培养基为TCBS及2％ NaCI的普通培养基。培养温度为28～30℃，培养1～2天后挑选优势菌落在含2％NaCl的琼 脂平板上划线分离数次，获得纯培养物后，用含15％甘油的生理盐水保存于一80℃低温冰箱 备用。同时，取病鱼的鳃、体表及鳍条等组织进行肉眼或显微镜检查。 (三)细菌分类鉴定 1．常规生化鉴定 纯培养的细菌经20℃、18-20h平皿培养物作革兰氏染色，进行细菌形态观察，生理生化 特性测定参照弧菌鉴定盒(杭州天和微生物试剂有限公司)及API20E[法国，生物梅里埃公司 (BioMerieux)]生化鉴定条进行。并参照《常见细菌系统鉴定手册》[3j及《伯杰氏细菌鉴定手 册》‘4|。 2．细菌的分子生物学方法鉴定 (1)细菌总DNA制备细菌基因组DNA的提取参照文献【5】进行。细菌的基因组DNA 在0．8％agarose电泳观察检验，并作为PCR扩增的模板。 (2)16S 引物[6|。PCR反应体系(50pL)为：10×Taq缓冲液5弘L，模板DNAl肛L，引物浓度为IO dNTP TaqDNA聚合酶0．5tLL，超纯水40．5pL，混匀。 ／J￡mol／L各1弘L，10t值mol／L1pL，5U以L 5min。取PCR产物7肛L，1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。PCR产物割胶回收纯化采用 DNA快速纯化／网收试剡盒(1匕京熏罱生物技术有限责任公司)。 第四节 黑鲷细菌性疾病的痛原研究 353 18一T载体，转化E．coli (3)PCR产物的克隆与测序PCR产物经纯化后，克隆到pMD TGl，挑取白色菌落，碱法提取质粒，用n￡I和EcoRI双酶切及PCR鉴定确认阳性重组质 377 PRISMTMDNA 粒。应用ABI Sequencer自动测序仪(上海博亚生物公司)对阳性重组质 粒进行测序，将所得序列运用NCBI的BALST程序进行同源序列比对。 (四)药物敏感试验 药物纸片购自浙江省军分区后勤部，共14种抗菌药物，参照纸片法抗菌药物敏感试验操 作标准进行【引。 (五)感染试验 x x x (1)细菌感染试验所用菌浓度为5108个／mL、5 106个／mL。每组6 107个／mI一5 尾黑鲷，腹腔注射菌液0．2mL／尾，对照组注射无菌生理盐水，剂量同试验组。饲养水温24～ 26℃。按Reed和Muench氏法计算LD50。 (2)组织滤液感染试验用同批病鱼的肝肾10倍稀释的匀浆液，经高速台式离心机以 6000r／min，5min及10 射0．2mL／尾，每组5尾