HBVPreS2S-rhGM-CSF融合基因表达质粒的构建与表达.pdfVIP

HCL M 论文汇编 MLCCCC4002 CJ-2 郭晓兰 邓健康 )ll北医学院附属医院检验科637000 拳道银 重庆医科大学微生物学与免疫学教研室400016 唐恩洁 川北医学院免疫学与分子生物学斫究所637007 大量的资料研究表明GM—CSF可增强人体对乙肝疫苗的免 1 2．2PCR产物的纯化、回收和T—A克隆：先按试剂盒说明 疫应答，尤其是对于那些免疫功能较差的个体…；而且GM—CSF具 有增加宿主ADCC作用，已用于慢性乙肝病毒携带者的试验性治 疗研究Ⅲ。另一方面，乙肝病毒前S2抗原(HBVPreS2)是乙肝病 毒表面的蛋白成分，能增强HbsAg的免疫愿性，可诱导和增强机 体产生抗HBs，同时针对前S2抗原产生的抗一PreS2，也具有中和 乙肝病毒的作用“。 在研究中，我们采用基因重组技术构建含有HBV 1．2 preS2+S 3转染参照GeneJammer转染说明进行。 1．24 基因($2S)与GM—CSF融合基因的表达载体，并在HepG2细胞中 表达，为探索增强乙肝疫苗免疫原性的途径和研制新型乙肝疫苗 胞总RNA，然后进行一步法RT—PcR。 奠定基础。 1．25 1．材料和方法 1，1材料 测融合蛋白表达的HbsAg。 l 1 l培养基及试剂培养基为RPMll640(GIBCOBRL)+ 10％FCS。试剂：限制性内切酶(TaKaRa)、PGEM—TVector Easy SystemI(Promega)、质粒不量提取试剂盒(上海华舜)、GeneJanl．素化的羊抗鼠IgG为二抗，检测融合基因表达质粒转染72小时后的 met转染试剂(STRATAGENE)、RNA提取试剂盒(EZ．N．A) HepG2细胞，经链霉菌生物素蛋白—过氧化物酶作用后DAB显色。 1．2．7Westem (omega)、一步法RT—PCR试剂盒RT—PCR试剂盒(AMV)(华美公 达 司)、鼠抗人HbsAg单克隆抗体(ad／ay)(北京科卫)，鼠抗人HB． VPres2单克隆抗体(北京大学肝病研究所)，鼠抗人GM—CSF单克 隆抗体(美国R＆D)，生物素标记的第二抗体、链霉菌抗生物素蛋抗鼠IgG为二抗，进行印迹实验。 白一过氧化物酶复合物以及免疫组化染色SP试剂盒(福州迈新)， 2．结果 2 DAB试剂盒(北京中山)、HbsAgMEIA检测试剂(美国雅培AB— 1融合基因的构建经酶切和DNA序列分析证实，构建 BO啊AXSYMSYSTEM) 的融合基因同预期的结果完全相符。融合基因的酶切、PCR和 1 1．2质粒、菌种及细胞 真核表达质粒PcDNA3．1、菌种DNA测序结果分别见图2—1和2—2。 adw2亚型基因全序 JMl09和HepG2细胞，均为本室保存。含HBV 组质粒PcDNA3 的质粒pEcob6由重庆医科大学肝炎所任红教授馈赠，含人GM— CSF全序的质粒s064由加拿大McMaster大学邢周教授馈赠。 1 2方法 1 2．1引物的设计与合成利用编码HBVPreS2和HBsAg共和450bp的特异性条带。 23 用同一个终止密码，设计1对引物扩增preS2+S基因($2S)，1对 引物扩增GM—CSF基因；为保持两种基因表达蛋白