西尼罗河病毒E蛋白基因表达载体构建.pdfVIP

第六谈全国会员代表大会暨第11次学术研讨会 生物学活性。同时本实验中的间接免疫荧光结果也发现，表达蛋白的昆虫细胞呈现强烈的荧光，说明所表 基酸同源性相一致。 我们的实验结果显示利用杆状病毒表达系统所表达的HeV和NiV的N蛋白有望成为一种更好的抗体 检测试剂，这将有利丁制各病毒的诊断试剂和在我国开展对两种病毒的流行病学调查工作，同时也为进一 步研究两种N蛋白的结构及抗原表位打下基础。 一 参考文献略 西尼罗河病毒E蛋自基因表达载体构建 项勋1段纲1花群义2周晓黎2董俊2扬云庆2尹尚莲2常华1曾昭文 (1．云南农业大学昆明 650201 2．云南出入境检验检疫局国家动物虫媒病重点实验室，昆明650228) 西尼罗病毒(WestNile 病毒共由70余种成员组成，同属这一科的还有登革热病病毒、日本脑炎病毒以及黄热病病毒等，它们大 多属丁二经蚊虫、蜱等媒介传播的虫媒病毒。西尼罗病毒广泛分布于非洲、中东和西亚，主要引起西尼罗河热 Nile (WestFever)。该病毒是重要的人畜共患传染病．能引起严重的公共卫生问题。且大多缺乏有效的治 疗和预防措施，给疾病控制提出了严峻的挑战。近几年西尼罗河病毒在全球特别是美国的流行，越来越受 到人们的关注。为此，各国都在建立西尼罗河病毒的快速检测和监测方法。但由于西尼罗与其所在的黄病 毒属成员之间具有抗原交叉反应原性，这为建立西尼罗河的诊断及预警系统带来了一定的困难．所以制备 两尼罗病毒的特异性抗原及抗体成为了建立WNV快速检测方法的首要任务。本研究旨在于通过构建西尼 罗病毒E蛋白基因的高效表达载体，获得具有生物学活性韵WNV抗原蛋白，从而为建立实验室的快速诊 断方法打好基础。 1材料与方法 1．1材料 1．1．1工程菌及表达栽体：感受态TOPO PMDl8-T载体．E．coli．JMl09工程菌。 (小量)提取试剂盒(上海华舜生物工程有限公司)，胶回收剂试盒(上海华上海华舜生物工程有限公司)。 1．2方法 1．2．1西尼罗河E基因的人工合成 个氨基酸，预测分子量为53KD。由大连宝生物公司合成E蛋白全基因，并 构建在PMD 18．T克隆载体上，转化E．coli．JMl09细菌备用。 1．2．2目的基因的亚克隆 根据Genebank中公开发表的西尼罗病毒(登录号AFl30363E)基因组E蛋白基因设计一对引物，上 taq酶从PMD TGcAcGlvI℃AcGGA·3；由宝生物大连公司合成，用高保真的LA18．T上扩增E基因，并 对PCR条件进行优化。 其他论文 (151aM)。lItL；primer-WNV-R(15州)，1皿：模板，O．5p．Ll 再延伸。10min。取10p．L用2％的琼脂糖凝胶120V电泳，观察扩增目的片断DNA的条带． 1．2．2目的片段的回收与鉴定 用上海华舜生物工程公司胶回收试剂盒回收目的片断。 LIGHTBLUE 用5％的TBE配制低熔点琼指糖50ml，溶化．冷却剑70℃左右。在琼脂糖中加入40IjtL 上样，电泳到目的条带在日光下清晰可见；在日光下割出含目的片段的胶块(尽可能多地去掉不含DNA 的琼脂糖)并称重，按每100mg琼脂糖加入300pL 放入同一个收集管中。在吸附柱中加入500／aL 附柱放入同一个收集管中，离心lmin。将吸附术入放一个干净的1．5ml的离心管中，在吸附膜中央加入30儿 观察胶回收目的片断DNA的条带。 1．2．3原核表迭载体的构建 取pBAD／Thio-Topo表达质粒和已制备好的感受态Topo10工程菌各1支于冰中缓慢溶化。取经胶回 收的PCR DNA产物2．5pL，Salt 10工程菌中，轻轻混匀．置冰中5min，42(2热激90SCC，立 后，置于冰中。取上述反应液2uL加入Topo 即冰浴。加入25CI止的SOC 反应液涂布于含50}lg／ml