人HSP75基因重组腺病毒载体构建及在C17.2神经干细胞的表达.pdfVIP

264 中国康复理论与实践2o15年3月第21卷第3期ChinJRehabilTheoryPratt，Mar．，2015，Vo1．21，No．3 DOI：10．3969j／．issn．1006—9771．2015．03．005 ·基础研究 · 人HSP75基因重组腺病毒载体构建及在C17．2神经干细胞的表达 王艳 ，陈庆状 ，蒋德旗 ，李明星 ，贾思远 ，朱宁 ，王勇 l摘要l 目的 构建HSP75基因重组腺病毒载体，观察HSP75蛋白在C17．2神经干细胞中的表达。方法 采用PCR方法从含人 HSP75基因质粒中扩增HSP75基因，连接到腺病毒穿梭质粒的多克隆位点区域，构建重组穿梭质粒pHBAd．MCM．HSP75．GFP，在 LipofiterMT转染试剂的介导下与腺病毒辅助骨架质粒pHBAd—BHGloxAE1，3Cre共转染HEK293细胞，整合包装成重组腺病毒 ， TCID50法测定病毒滴度。使用荧光显微镜 、流式细胞仪和Westemblotting观察重组腺病毒在C17．2细胞中的感染情况及HSP75蛋 白的表达水平。结果 通过酶切鉴定、测序、PCR鉴定，HSP75基因已正确插入穿梭质粒中，并与病毒骨架质粒整合包装成重组 腺病毒；重组腺病毒滴度为 1．O×10PFU／ml；Westernblotting检测，转染后的神经干细胞表达HSP75蛋白。结论 HSP75重组腺病 毒载体成功构建，对C17．2神经干细胞具有较高的表达效力。 关【键词l热休克蛋白75；重组腺病毒载体；C17．2神经干细胞 ConstructionofAdenovirusVectorCarryingHumanHSP75GeneandExpressinginC17．2NeuralStem Cells WANGYan,CHENQing-zhuang,JIANGDe—qi,L1Ming-xing,JIASi-yuan，ZHUNing,WANGYong 1．a．DepartmentofPharmacy；b．DepartmentofBurns，ZhujiangHospital，SouthernMedicalUniversity,Guang— zhou，Guangdong510282，China；2．DepartmentofPharmacy,GuangzhouHospitalofIntegratedTraditionalandWest Medicine，Guangzhou，Guangdong510800，China；3．DepartmentofPharmacy,theThirdPeople’sHospitalofNanhai， Foshan，Guangdong528244，China Abstract：ObjectiveToconstructrecombinantadenovirusvectorcarryingthehumanHSP75geneanddetectitsexpressioninC17．2 neuralstem cells．M ethodsHSP75genewasamplifiedfrom plasmidcarryingthehumanHSP75geneandinsertedtothepolyclonalsiteof adenovirusshuttleplasmidpHBAd·M·CMV-GFE HEK293cellswereCO--transfectedwiththeconstructedrecombinantshuttleplasmidpH-· BAd·MCMV-HSP75一GFPandlargeadenovirushelperplasmidpHBAd—BHGloxAE1，3CreinmediationofLipofiterMT．Therecombinantad— enoviruswasobtaniedandhteviraltiterwasexaminedusingthemethodofTCID50．Thetrna sfectionandexpressionofHSP75wasdetect— edbyfluorescencemicroscope，flow cytometerandWestern blotting．ResultsRestrictiondigestion，sequencingnaalysisandPCRamplifica