汉族家族性高胆固醇血症患者靶向外显子捕获重测序方法建立及其在基因诊断中应用.pdfVIP

汉族家族性高胆固醇血症患者靶向外显子捕获重测序 方法的建立及其在基因诊断中的应用 博士研究生：武文峰导师：王绿娅首都医科大学附属北京安贞医院 【摘要】 家族性高胆固醇血症(FH)是常见且严重的脂质代谢遗传性疾病，临床分为 纯合和杂合两种类型。纯合子患者动脉粥样硬化(As)严重且多在年幼时发病，且治疗较为 困难，大多数在20岁前死于冠心病。杂合子患者As进展加速，心血管疾病发生比一般人群 高100倍，但可防可治；杂合子因无明显的临床体征，不易被发现当患者出现早发冠心病的 表现后才会认识到血脂异常。因此早期诊断早期干预对于预防As有重要意义。目前认为FH 的主要病理基础是低密度脂蛋白受体(LDLR)、枯草溶菌素转化酶9(PcSK9)和载脂蛋白B (ApoB)基因突变导致胆固醇代谢障碍。大量研究发现，FH患者已知致病基因突变较散在， 有些甚至不能重复和验证，但仍有约4096的患者检测不到突变。新近报道多采用全外显子组 捕获结合二代测序或全基因组测序，虽然能检测到新的基因突变和位点，但有成本高，周期 长，数据分析效率低等缺点，故我们提出了设计胆固醇代谢相关的基因靶向外显子捕获芯片 以缩小筛选范围，结合二代测序的方法检测FH的已知和新的致病基因突变，对于明确FH 患者的基因诊断和了解汉族患者的遗传背景，实现早期干预防治As有重要的意义。 目的根据诊断标准收集FH患者；根据前期调查的国际最新全基因组关联研究(GwAs) 结果，95个与胆固醇代谢相关的基因(位点)，结合胆酸代谢过程中的基因，设计靶向外显 子捕获芯片进行外显子富集并结合二代测序结合建立新的检测方法，检测已经明确基因诊断 的FH患者外周血DNA验证该芯片的可靠性；进而对未检测到基因突变的患者进行检测，采 用传统测序在家系成员中验证，生物信息学明确导致胆固醇水平增高的可能的分子机制。对 筛查过程中未见报道的特殊突变进行体外细胞学实验探讨突变对胆固醇代谢的影响，探讨该 患者高胆固醇血症的遗传机制。为了解汉族FH患者的遗传背景提供依据。 方法1．查阅国际最新的GwAs结果95个与胆固醇代谢相关的基因(位点)，结合胆酸 代谢过程中的基因，通过巧妙设计简化筛选范围，建立胆固醇和胆酸代谢相关基因的靶向外 显子捕获芯片； 2．收集40例患者的病史，进行体格和生化指标检查； 3．入选10例已知基因诊断的FH杂合患者，提取10例患者的DNA；应用靶向外显子捕 获及测序并生物信息学分析筛选致病基因，验证芯片和测序平台的可靠性； 4．入选15例纯合表型但常规方法未检测出基因突变的患者和15例新入组的纯合患者； 提取30例患者的DNA，应用靶向外显子捕获及测序筛选已知和未知致病基因，经生物信息 学分析和家系内验证明确未知基因突变，检验芯片发现未知突变的能力； 5．对发现新突变的先证者进行核心家系验证，明确突变来源； 6．对捕获测序的sNP进行综合分析，明确中国汉族人群与血脂水平密切相关的基因； 7．结合正常人测序数据及患者本身的血脂水平筛选汉族FH人群的易感sNP； 8．抽取新突变患者静脉血，流式细胞仪检测患者外周血淋巴细胞的受体功能，验证新突 FIve．Con§nentIntefna{沁憾leord【e旧noeonC8f舶v盎sculafDlse毫se and∞一Ye8r An曲en Med；caI Annivefs鑫ryMe毒h峭研Bo《1孵9 Hospitala耩Ha±ed插eap计aiun阻ersity ～6n5一 Fl 交是否为致病性突变； 9．对l例新突变江苏汉族FH家系先证者进行病史询问、心电图、眼底检查、周围血管 及心脏超声、核素心肌灌注显像检查， 10．结合家系成员发病情况分析结果，根据陈再嘉主编的《临床冠心病学》和美国诊断 一标准明确临床诊断，初步确定遗传模式； 结果1．设计靶向捕获芯片仅包含167个基因，大大缩小了筛选范围： 2．入选患者均符合家族性高胆固醇血症诊断，排除继发性高脂血症，部分患者有皮肤黄 色瘤； 3．靶向外显子捕获测序方法可以100％筛选出10例己知基因诊断患者的突变基因及位点， 检测出已知突变基因和位点，证明靶向外显子捕获测序