绿色荧光蛋白细胞的保存及细胞周期分析.pdfVIP

维普资讯 第 36卷第 6期第 798页 华中科技大学学报 (医学版) VoI_36 No．6 P．798 2007年 12月 ActaMedUnivSciTechnolHuazhong Dee． 2007 绿色荧光蛋 白细胞的保存及细胞周期分析* 刘双又 李小兰 肖 薇 陶德定 罗学来 高 霞 胡俊波△ 龚建平 华 中科技大学 同济医学院附属 同济医院分子医学中心，武汉 430030 摘要 目的 探讨在绿色荧光蛋 白(GFP)质粒转染后的细胞中，既能最大限度地保存 GFP阳性细胞又有利于细胞 周期分析 的固定方法 。方法 以胃癌 MKN一28和乳腺癌 MCF一7细胞为模型，脂质体 Lipofectamine20OO转染细胞 ，转染 后 的细胞分别用 ：①8O 乙醇 固定；②0．1 、0．25 、0．5 和 1．0 的多聚甲醛 固定 ；③0．1 、0．25 、0．5 、1．0 多聚 甲醛 4℃固定 30min后再用 8O％乙醇 固定等 3种方法 固定细胞 ，然后用含 0．1 triton的PI染色 ，在流式细胞仪上检 测 GFP的 自发绿色荧光及行细胞周期分析 。结果 单纯 乙醇 固定的细胞 中GFP均消失 。单纯 0．25 ～1．0 的多聚 甲醛 固定后的细胞不能得到有效的DNA直方 图，单纯 0．1 的甲醛固定的细胞虽可得到 良好的直方 图，但 PI染液 中的 triton破坏 了大部分的GFP。先 甲醛再 乙醇 固定的细胞 中，0．5 ～1．0 的甲醛可较好地防止 乙醇和 triton对绿色荧 光蛋白的破坏作用 ，保留下 2／3的GFP阳性细胞 ，0．5 的甲醛 固定的细胞可得到 CV值8 的G。／G期峰，而 1．0 甲醛固定后 的细胞 CV值8 。结论 在 GFP质粒转染后 的细胞中，先用 0．5 的多聚 甲醛 固定细胞 30min后再用 乙 醇固定，既能最大限度地保存 GFP，又可得到CV值 良好的DNA直方图。若不考虑保留GFP，或普通细胞作细胞周期 分析时，单纯 0．1 的多聚甲醛固定细胞，即可得到与传统的单纯乙醇固定细胞相似的CV值很小的DNA直方图。 关键词 绿色荧光蛋 白； 流式细胞术； 细胞周期 ； 细胞 固定； 多聚 甲醛 中图法分类号 R34-33 PreservationofGreen FluorescentProteinandAnalysisofCellCycle LiuShuangyou，LiXiaolan，XiaoW eietal CenterofMolecularMedicine，TongJiHospital，TongJiMedicalCollege， HuazhongUniversityofScienceandTechnology，Wuhan430030 Abstract 0bjective Toinvestigateaneasyandusefu1fixationintransfectedadherentcellswithaGFP—encodingplasmid． whichallowedthecellsnotonlytomaintainmostofGFPbutalsotoacquireadequateDNA histogram．M ethods Thegastric tumorMKN一28andbreastcancerMCF一7cel11ineswereusedasthemodels．Cellsweretransfectedwith lipofectamine2000． ThetransfectedcellswerefixedwithA (8O ethano1)，B (0．1 ，0．25 ，0．5 ，1．0 formaldehyde)，C (0．1 ，0．25 ， 0．5 ，1．0 for