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目的蛋白表达与纯化protocol 小量表达测试： 挑一单克隆到3ml LB（含抗生素）中，370C，220rpm振荡培养10h~12h。 保种：700μl菌液+400μl 80%灭菌甘油，充分混匀后置于-800C保存。 扩大培养：以1:100接菌，即取50μl菌液到5ml LB（含抗生素）中，370C，220rpm振荡培养2h~3h至OD值达到0.6。 对照取样：取1ml菌液，12000rpm离心1min，弃尽上清，-200C保存。对照 另取1ml菌液于一新的试管中，加1/1000 IPTG（终浓度为1mM），370C，220rpm振荡培养3h后收菌：12000rpm离心1min，弃尽上清，-200C保存。370C样品 其余约3ml菌液于160C，220rpm继续振荡培养1h后，加0.5/1000 IPTG（终浓度为0.5mM），160C，220rpm振荡培养12~24h（通常18h）后收菌：12000rpm离心1min，弃尽上清，-200C保存。160C样品 Bugbuster分别处理上述三个样品，取20μl总蛋白，其余离心后分离上清和沉淀，进行SDS电泳鉴定，上样顺序为： 对照 370C样品 160C样品 总蛋白 上清 沉淀 总蛋白 上清 沉淀 总蛋白 上清 沉淀 若目的蛋白在上清中有表达，则可以进行大量表达与纯化，具体操作如下。 大量表达： 挑一单克隆到7.5ml LB（含抗生素）中，370C，220rpm振荡培养10h~12h。 注意：此步用50ml离心管摇菌！ 扩大培养：以1:100接菌，即取将上述7.5ml菌液全部接到750ml TB（含抗生素）中，370C，220rpm振荡培养4h~5h至OD值达到1.0。 对照取样：取1ml菌液，12000rpm离心1min，弃尽上清，-200C保存。（对照） 其余约菌液于160C，220rpm继续振荡培养1h后，加0.5/1000 IPTG（终浓度为0.5mM），160C，220rpm振荡培养12~24h（通常18h）后收菌：6000rpm、40C离心10min，弃尽上清，取一点沉淀做表达鉴定（160C样品），其余-200C保存。 Bugbuster分别处理上述两个样品，进行SDS电泳鉴定。（同小量表达中的7） 菌体破碎（高压破菌法）： 若目的蛋白在上清中有表达，则可取剩余菌体N g (根据目的蛋白的表达量而定)，用4-6×N ml的lysis buffer将菌体重悬，加入0.1mM的PMSF，置于50/100ml小烧杯中，并将烧杯置于冰上。 用超声破碎仪进行破碎，功率一般为100W~200W，超声时间为3s，间隙时间为5s，工作次数一般为99×4次。 将破碎后的菌液移入50ml BECKMAN高速离心管中，18000rpm、40C离心30-40min，将上清移入一个新的50ml离心管中。 Ni柱亲和层析： Lysis buffer: 50mM Tris, 300mM NaCl, pH 8.0（可加入5-10%的甘油和1mMdTT，20mM咪唑） Wash buffer: 50mM Tris, 300mM NaCl, 20mM 咪唑, pH 8.0 Elution buffer: 50mM Tris, 300mM NaCl, 500mM 咪唑, pH 8.0 取适量的beads灌入玻璃柱中，用大量的ddH2O冲洗beads，一般为10CV×5（CV代表柱体积，下同）。 用lysis buffer进行平衡：10CV×5。 将平衡好的beads移入菌体破碎最后得到的上清中，Mix 1~2h。 500g，40C离心2min，收集上清——flow-through。 加入50ml wash buffer，500g，40C离心2min，收集上清——wash 1。 加入50ml wash buffer，500g，40C离心2min，收集上清——wash 2。 加入50ml wash buffer，500g，40C离心2min，收集上清——wash 3。 将beads灌入玻璃柱中，继续用wash buffer洗10CV×3。 用Elution buffer洗脱：0.5CV×10，用EP管分别收集eluates。 SDS电泳鉴定。 Resin regeneration: 用0.1M EDTA洗2CV（清洗至beads为无色）。 ddH2O洗5CV。 0.1M NaOH洗2CV。 ddH2O洗5CV。 加2CV的NiCl2。 ddH2O洗5CV。 用20%乙醇洗2次beads，置于4~80C保存。 GST柱亲和层析： Lysis buffer: 1×PBS (140mM NaCl, 2.