外膜通道蛋白To(l)C对肠外致病性大肠杆菌耐药性与生物膜形成能力的影响.pdfVIP

外膜通道蛋白TolC对肠外致病性大肠杆菌 耐药性和生物膜形成能力的影响 侯博 孟宪荣 张丽嫒 谭 臣 金卉 吴斌 毕丁仁 栗绍文1 农业微生物学国家重点实验室，华中农业大学动物医学院，武汉430070 摘要：肠外致病性大肠杆菌(ExPEC)是一种重要的人兽共患病原和食源性病原，近年来 日益受到关注。TolC是革兰氏阴性菌广泛存在的一种保守外膜通道蛋白，本研究以猪源 ExPEC042野生株、tolC基因突变株及其回复补偿株作为试验菌株，探讨了TolC对ExPEC 耐药性和生物膜形成能力的影响。结果显示：(1)tolC基因突变后可逆转野生株对多种抗 菌药物的耐受性，而回复补偿株可恢复这种多重耐药性，证实TolC与ExPEC多重耐药性 密切相关；(2)结晶紫实验和扫描电镜实验表明tolC基因突变严重影响细菌的生物膜形成 能力，刚果红实验和荧光白实验证实tolC基因突变减少卷曲菌毛的形成而增加纤维素的形 成，证实TolC与ExPEC生物膜形成密切相关，且与生物膜两种主要胞外基质成分卷曲菌 毛和纤维素的产生有密切联系。 关键词：TolC;肠外致病性大肠杆菌；耐药性；生物膜 第十二届学术研讨会 12，采用同源重组技术 因组全序列已经测定；tolC基因缺失突变株是利用自杀性载体pREl 构建；回复补偿株是通过构建补偿质粒pHSG396一tolC制备。 1．2MIC测定 ‘ 同抗菌物质(均为中检所标准品)的最低抑菌浓度(MIC)。 1．3结晶紫生物膜实验将试验菌株接种LB培养基，3712振荡培养过夜，培养物用新鲜M9 培养基进行1：100稀释，分别加入96孔细胞培养板中，每孔100pL，每株细菌设8个重复； 1％ 养24h或5d。将过夜培养物轻轻吸出，用灭菌蒸馏水洗涤微孔。96孔板每孔加125pL l％结晶紫染色15min，用流水轻轻冲掉染 测定OD630n。值；在24孔细胞培养板中，用1ml 液，拍照记录结果。 28(2 1．4扫描电镜实验(SEM)将试验菌株接种到加入盖玻片的24孔板中的M9培养基， 有氧条件培养5天。取出盖玻片，用PBS洗三遍后，2．5％戊二醛固定过夜，再用PBS洗 异戊酯，每次30min，临界点干燥，喷金后用扫描显微镜观察。 1．5刚果红实验在M9培养基(添加葡萄糖)中添加1．5％的琼脂，添加刚果红和考马斯 菌落生长情况。 Brightener 紫外光下观察菌落生长情况。 2．结果 2．1 TolC蛋白对抗曹药物敏感性的影响野生株、缺失株、回补株对不同化学物质的MIC 结果见表2。缺失株对四环素、环丙沙星、氯霉素、阿米卡星、氟苯尼考、红霉素、诺氟 沙星等抗菌物质的敏感性均显著增强，可降低MIC值至4．32倍，而回补株基本上与野生 株相同：不同菌株对氨苄青霉素、链霉素、庆大霉素的敏感性无明显差异。 表l不同抗菌药物对构建菌株的最低抑菌浓度(MIC)(单位pg／m1) 2．2．TolC蛋白对生物膜形成的影响细菌在96孔和24孔细胞培养板中经过培养、染色， 第十二届学术研讨会 结果表明所有菌株均在培养24h后，不形成生物膜，而当在培养5天后，其中野生株和回 补株形成强生物膜，而缺失株形成生物膜的能力极其微弱(图1A，1c)；半定量分析表明 缺失突变株生物膜形成能力与野生株和回补株相比，显著下降(P0．01)(图lB)。扫描 电镜结果显示野生菌发生细菌的聚集和形成生物膜，表面可见明显菌毛产生，而TolC突变 株未发生细菌的聚集和形成生物膜，表面未见菌毛产生，进一步证实TolC蛋白对于ExPEC 菌毛形成、细菌聚集和形成生物膜是至关重要的(图1D)。 A