血虚大鼠含熟地黄血清的高效液相色谱分析.docVIP

血虚大鼠含熟地黄血清高效液相色谱分析 崔 瑛1*，房晓娜1，丁 岗2 (1.河南中医学院，河南 郑州450008 2.江苏中康药物科技有限公司，江苏 南京211100) [摘要]：目的：对熟地黄含药血清进行分析，探索熟地黄补血药效的物质基础。方法：在血虚大鼠动物模型上，用高效液相色谱法，通过比较熟地黄药材，血虚大鼠含药血清，正常大鼠血清的高效液相指纹图谱，研究熟地黄血中移行成分。结果：口服给药后，含药血清中与熟地黄原药材相同位置的波峰。 结论： [关键词]：熟地黄；含药血清高效液相色谱法 熟地黄为玄参科植物地黄Rehmannia glutinosa Libosch.的根而成[1]。具有滋阴补血，益精填髓的功效。研究发现，熟地黄中含有多糖、梓醇、氨基酸、苷类、5-羟甲基糠醛等多种化学成分；熟地黄对免疫系统、激素代谢、心血管系统、骨髓造血系统等方面均具有一定的药理作用[2]。 虽然对熟地黄化学成分的研究较多，但这些常规的化学分析方法，还不能有效解决熟地黄药效的物质基础问题。因此，作者根据中医药理论，结合现代技术手段，提出“病证—效应—血清药化学分析”研究熟地黄药效物质的思路[3]。本实验上述思路的在血虚证候大鼠动物模型上，观察药效、分析含熟地黄的血清，认识熟地黄血液中的移行成分，为筛选确定熟地黄的药效物质奠定基础。 1.材料 1.1 实验动物 清洁级SD大鼠72只，雄性，体重150(0g，购自河南省动物实验中心，合格证号：2005-00011.2 试剂药物 乙酰苯肼国药集团化学试剂有限公司，批号：化学纯，含量 [基金项目]：国家自然科学基金项目 [通讯作者]：崔瑛，Tel ：0371E-mail：cyexin@ ≥98.0%；环磷酰胺江苏恒瑞医药股份有限公司，国药准字批号每支0.2 g；复方阿胶浆山东东阿胶股份有限公司，国药准字20 mL/支；EDTA-Na2：取EDTA-Na2 1 g加生理盐水10 mL，溶解完全，用作抗凝剂。甲醇，乙腈为色谱纯，水为自制双蒸水，其它试剂均为市售分析纯。 生地黄药材于2008年10月购自河南省焦作市武陟县，经河南中医学院药学科陈随清教授鉴定为玄参科植物地黄Rehmannia glutinos Lilosch的干燥块根，参照《中国药典》（2005年版，一部）酒蒸法炮制成熟地黄。 1.3 仪器 Waters2695高效液相色谱仪，Waters2996二极管阵列检测器，Empower色谱工作站； RE52AA旋转蒸发仪上海亚荣生化仪器厂；DZF-6020真空干燥箱上海精宏实验设备有限公司；高速冷冻离心机北京医用离心机厂；涡流混合器姜堰市新康医疗器械有限公司氮吹仪；Hema-screen 血细胞分析仪2 方法与结果 2.1 色谱条件 色谱柱：Dikma Platisil C18柱（4.6 mm(250 mm，5 (m）；流动相：A(乙腈)-B(0.1%磷酸)梯度洗脱，0～20 min（B：99.5%），20～50 min（B：99.5%～97.6%），50～80 min（B：97.6%～80%），80～95 min（B：80%～67%）检测波长：254 nm；流速：1.0 mg·mL-1 进样量：10 (L；柱温：30 ℃； 记录图谱90 min。 2.2 熟地黄供试液的制备 称取熟地黄（80 ℃，减压干燥24 h）5 g，精密称量，第一次加10倍量水浸30 min煎45 min，第二次加8倍量水煎30 min，合并煎液，滤过，减压浓缩至10 mL，加甲醇至含醇量95%，4 ℃冰箱过夜，减压回收甲醇，用0.1%磷酸溶液定容至25 mL，过0.22 (m滤膜，供高效液相色谱分析用。 2.3 灌胃药液的制备 取干燥熟地黄饮片280 g。第一次加10倍量水浸30 min煎45 min，第二次加8倍量水煎30 min，合并两次煎液,浓缩至400 mL，即0.7 g·mL-1，供大鼠灌胃用。 2.模型的制备[4、5]与给药 大鼠随机分为7组，正常对照组，虚模型组，阳性对照组（复方阿胶浆组），熟地黄低剂量组，熟地黄高剂量组，熟地黄多糖组及正常给药组。正常给药组6只，其他各组每组12只。 除正常对照组正常给药组外，其余各组于实验第2 d、第5 d分别皮下注射乙酰苯肼20mg·kg-1、40 mg·kg-1。第5日起腹腔注射环磷酰胺20 mg·kg-1，连续4 d。正常对照组在上述时间点分别皮下注射和腹腔注射等体积的生理盐水。于实验的第1天开始给药，复方阿胶浆组剂量为10 mL·kg-1，熟地黄高剂量组7 g·kg-1。熟地黄低剂量组3.5 g·kg-1，熟地黄多糖组0.4 g·kg-17