产气肠杆菌(E．aerogenes+IAM1138)甲酸氢酶基因的克隆和高效产氢工程菌的构建.pdfVIP

2007年中国微生物学会学术年会 173 NAends byPCR)方法分析表明hsp70基因的转录启始位点位于ATG之前4个碱基处。 M 性，结果表明NnrnHsp70蛋白在2．OKCl缓冲液中ATPase活性最大，而NaCl浓度对 液中NnmHsp70蛋白也有ATPase活性。Hsp70蛋白起分子伴侣作用具有种的特异性， ATPase活性是其功能的基础，由于NnmHsp70蛋白在低盐环境的可溶性及其ATPase 活性，因此我们推测其在低盐环境中可能有功能。大肠杆菌中 DnaK(Hsp70)蛋白在高温生长和入噬菌体的复制中起着关键性作用，故大肠杆菌 dnaK(hsp70)缺陷突变株将不能在高温(42℃)下生长，也不能感染入噬菌体。将携带 sp70在转化子中获得了表达，在4212培养转化子可以生长，并且也可以感染入噬菌体。 结果表明NnmHsp70蛋白可以代替大肠杆菌的DnaK蛋白行使其分子伴侣功能，提示 NnmHsp70在嗜盐古生菌对抗低盐环境的压力中起着重要作用。 IAMl 产气肠杆菌(E．aerogenes138)甲酸氢酶基因 的克隆及高效产氢工程菌的构建 赵洪新马 垄卢 元张种邢新会 (清华大学化工系生物化工研究所，北京，100084) 氢气具有热能密度大、热转化效率高、燃烧产物是水、不造成环境污染等优点，是一 种理想可再生的清洁能源。 制备氢气的方法主要有化石燃料制氢、电解制氢、光化制氢、热解制氢、放射能水解 制氢、等离子电化学法制氢和生物制氢等。但除了生物制氢外，其他的制氢方法都要消 耗大量能源如电能、化石能源等。特别是利用化石燃料制氢，会产生温室效应气体，造 成环境污染，给环境带来压力。而生物制氢具有减少环境污染、节约资源、成本低、可再 生、反应条件温和等优点，所以生物制氢技术具有广阔开发应用前景。 生物制氢过程中，产氢效率低是限制其应用的净瓶问题。仅从生产工艺方面研究， 尽管有一定的进展，但难以满足应用的要求。因此，研究开发产氢效率高的新菌株，寻 找新的氢酶基因，并对关键酶的基因进行改造，强化产氢过程，提高产氢效率，是解决生 174 2007年中国微生物学会学术年会 物制氢瓶颈问题的有效途径。 IAMll38)，是一生长速度快，可进行高密度培 产气肠杆菌(Enterobacter．aerogenes 养的兼性厌氧发酵型革兰氏阴性菌。研究表明其可利用甲酸、甲酸盐或发酵过程中可 产甲酸及糖和有机酸等为底物生产氢气，而且利用甲酸发酵制氢，是该菌产氢的重要途 径之一，因此该菌是一株极具研究价值的生物制氢菌株。 IAMll38)为出发菌株，对甲酸氢酶基因簇进行 本研究以产气肠杆菌(E．aerogenes 克隆。从Genebank中已公布的甲酸氢酶基因序列，通过同源对比，在保守的区域设计 引物，以产气肠杆菌总DNA为模板，进行PCR扩增，获得543lbp的核苷酸序列(Gene— bankNOEF601l 25)。经DNA序列分析及网上BLAST同源性比较，发现该片段与肠杆 IAMll38 菌科相近几个属中的NiFe氢酶一3片段有最高的同源性，说明E．aerogenes 中含有NiFe氢酶一3的同源基因。分析确定该片段为甲酸氢酶(NiFe氢酶一3)基因簇 上的hycABCDE基因，表明我们成功的从产气肠杆菌中克隆到了甲酸氢酶基因，其中基 因hycA编码的HycA蛋白为甲酸氢酶表达的阻遏蛋白，基因hycE的产物，为甲酸氢酶 的大亚基；同时在已知的吸氢酶一2(NiFe氢酶一2)保守区设计引物，克隆出790 bp NO DNA片段(Genebank EF601126)，经DNA序列分析及网上BLAST同源性比较，确 定为吸氢酶一2的小亚基hybO基囚。前期我们研究小组首次发现了产气肠杆菌具