1分子生物学常用技术2杂交.ppt

斑点杂交:是将被检DNA/RNA点到膜上，烘烤固定。这种方法耗时短，可做半定量分析。一张膜上可同时检测多个样品，为使点样准确方便，市售有多种多管吸印仪（Manifold），如MinifoldⅠ和Ⅱ、Bio-Dot(Bio-Rad)和Hybri-Dot，它们有许多孔，样品加到孔中，在负压下就会流到膜上呈斑点状或狭缝状。膜烤干或紫外线照射以固定标本。 2．斑点杂交（Dot blot）。 （1）DNA斑点杂交： ①先将膜在水中浸湿，再放到15×SSC中。 ②将DNA样品溶于水或TE，煮沸5min，冰中速冷。 ③用铅笔在滤膜上标好位置,将DNA点样于膜上, 5μl(2~10μg DNA)。 ④将膜烘干，密封保存备用。 （2）RNA斑点杂交： 每个样品至多加10μg总RNA溶于5μl DEPC水， 加 5μl甲醛/SSC缓冲液（10×SSC中含6.15mol/L甲 醛），使RNA变性，然后取5-8μl点样于处理好的滤膜 上，烘干。 5．组织原位杂交（Tissue in situ hybridization） 组织原位杂交简称原位杂交，指组织或细胞的原位杂交，它与菌落原位杂交不同，菌落原位杂交需裂解细菌释出DNA，然后进行杂交，而组织原位杂交是经适当处理后，使细胞通透性增加，让探针进入细胞内与DNA或RNA杂交。 原位杂交的探针: 单链或双链DNA，RNA。长度:100-400nt，过长则杂交率减低。寡核苷酸探针（16-30 nt）能自由出入细菌和组织细胞壁，杂交效率明显高于长探针. 寡核苷酸探针, 小DNA探针或体外转录标记的RNA探针是组织原位杂交优选探针。 原位杂交程序: 组织细胞的固定 预杂交 杂交 冲洗 放射自显影 / 免疫酶法显色以显示杂交结果 原位杂交可以确定探针互补序列在胞内的空间位置，这一点具有重要的生物学和病理学意义。 1): 对致密染色体DNA的原位杂交可用于显示按规定序列的位置，对分裂期间核DNA的杂交可研究特定序列在染色质内的功能排布； 2): 与细胞RNA的杂交可精确分析任何一种RNA在细胞中和组织中的分布。此外， 3):原位杂交还是显示细胞亚群分布和动向 4): 病原微生物存在方式和部位。 组织原位杂交用途：定位, 定量 Western blot  原理:  Western Blot与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。  斯坦福大学的乔治·斯塔克（George Stark）。在尼尔·伯奈特（Neal Burnette）于1981年所著的《分析生物化学》（Analytical Biochemistry）中首次被称为Western Blot。  蛋白质 抗体 酶或同位素标记的第二抗体 底物显色或放射自显影 + + 分类 Western Blot显色的方法主要有以下几种：i. 放射自显影ii. 底物化学发光ECLiii. 底物荧光ECFiv. 底物DAB呈色现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色，体同水平和实验条件的是用第一种方法，目前发表文章通常是用底物化学发光ECL。只要买现成的试剂盒就行，操作也比较简单，原理如下（二抗用HRP标记）：反应底物为过氧化物+鲁米诺，如遇到HRP，即发光，可使胶片曝光，就可洗出条带。 电泳印迹 电泳转移即电泳印迹。它是利用低电压，大电流的直流电场使凝胶电泳的分离区带或电泳斑点转移到特定的膜上 。 电泳槽 适用于将凝胶电泳的图谱转移到固相转移膜上 DF-9夹芯电泳槽 可做各种凝胶电泳 DF-13A转移电泳槽 转移电泳槽 转移缓冲液 121204 cell clones DNA digested with EcoRI 1