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福建In 第三届海洋生物高技术论坛 200s.08.19.23
斑马鱼作为抗肿瘤海洋药物研究模型:
I,胸腺苷酸合成酶基因的克隆表达
在必矿1’2学荣丽1 承培笋1 林旁矽n
(1中国科学院海洋研究所,青岛266071)
00039)
(2中国科学院研究生院,北京1
摘要胸腺苷酸合成酶(Thymidylate
dTMP再进一步转化为dTTP,后者是DNA合成的重要前体,多年来Ts一直作为癌症化疗
的一个重要靶点,斑马鱼作为一种重要的模式生物,已成功用于多种药物筛选模型的构建,
但斑马鱼TS的基因序列与功能尚未见报道。本研究采用RT.PCR和RACE方法,从斑马鱼
胚胎中克隆出TS的cDNA全长序列,分析表明它的编码序列含有954个核苷酸,编码一个
318个氨基酸的蛋白序列,分子量为36kD。为了研究斑马鱼TS蛋白的性质,将该cDNA
诱导表达,纯化后获得了高纯度的均一性TS蛋白。酶学分析表明斑马鱼Ts蛋白在28℃表现
出比较高的生物活性,Km值与人等生物的TS蛋白比较接近。
关键词:斑马鱼,胸腺苷酸合成酶,克隆表达,催化活性
0引言
胸腺苷酸合成酶(TS)是一种叶酸依赖性酶,它催化dUMP和甲基化四氢叶酸生成dTMP
过胸腺苷酸激酶催化的拯救途径获得,但TS催化反应是dTMP细胞内从头合成的唯一来源
[2-4]。考虑到它在DNA生物合成的中心作用,抑制这一反应会导致细胞生长发育的停滞,TS
成为癌症化疗的一个重要靶点【5,6】。斑马鱼是一种非常好的模式生物,它适合用于遗传学、胚
胎学、发育生物学和细胞生物学的研究【.卜91。斑马鱼胚胎作为研究材料有很多优点,包括容易
保存和进行药物处理,胚胎体外受精,胚体透明,且发育速度比较快【lm比]。
现在20多种生物的TS基因已经克隆测序,其中一些TS蛋白的空间结构已通过X一射线
进行鉴定。我们前期的研究表明人和大肠杆菌的TS基因的表达调控是多水平控制的,包括
转录水平、翻译水平和翻译后水平,然而对鱼类的TS的调控机制却知之甚少。我们正在利
用斑马鱼作为抗癌药物筛选的模式生物,以发展新的TS表达抑制剂。在本研究中,我们克
隆了斑马鱼Ts全长cDNA序列,与大肠杆菌、小鼠和人的Ts序列进行了比较。我们还将
斑马鱼的TS基因在肠杆大菌中进行表达,并对表达产物进行了分离纯化、活性鉴定以及酶
学性质研究。
}
通讯作者:Email:linxiukun@yahoo.corn
730
藕建曩n 第三届海洋生物高技术论坛 2005.08.19-23
1材料与方法
1。1材料
斑马鱼在本实验室饲养,大肠杆菌BL21(DE3)为实验室保存,反转录酶和DNA聚合酶购自
SMARTRACE克隆试剂
取试剂盒及PCR纯化试剂盒购自上海华舜生物工程有限公司,CLOTECH
盒购自CLOTECH公司,测序由上海博亚生物公司完成,pET-28a为Novagen公司产品。
1.2RT-PCR中eDNA第一链的合成
总RNA从斑马鱼胚胎中提取。总RNA
样得到cDNA第一链作为模板,进行PCR反应。
1.3克隆斑马鱼TSeDNA序列
根据人和大肠杆菌TS的保守序列设计~对兼并引物,引物序列如下:
正义引物:5’.GTTI:ATGGYTrYCARTGG一3’:
反义引物:5-GGCRATGTTGAANGGRAC-3’。
SMART
(R代表嘌呤,N代表核昔酸,Y代表嘧啶。)利用CLOTECHRACE克隆试剂
盒,通过5-RACE和3-RACE来获得斑马鱼TScDNA序列的两个末端,应用的特异序列
PCR引物如下:
正义引物:5’一GGCATTITGGAGCCGAATAC一3’;
反义引物:5’一GAGACCGATGTCTCCCGATC.3’。
1.4TS表达载体的构建
据已测序确定的斑马鱼TScDNA和表达载体pE
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