OATP1B1和CYP3A4基因多态性对阿托伐他汀转运代谢影响的分子机制研究.pdfVIP

OATP1B1及CYP3A4基因多态性对阿托伐他汀转运代谢 影响的分子机制研究 袁钊 熊玉卿 摘要：目的 研究OATP1B1及CYP3A4基因多态性对阿托伐他汀转运及代谢的差异及产生差异的分子机 制。方法 通过构建野生型及不同位点突变型OATP1B1重组质粒模型，研究阿托伐他汀在不同OATP1B1 基因型个体中药物体外转运的差异及其分子机制；并通过野生型及不同位点突变型CYP3A4重组酶，研究 阿托伐他汀在不同CYP3A4基因型个体中体外代谢的差异及产生差异的分子机制。结果 OATP1BI*5(521T＞C)基因型个体对ATV的转运活性低于野生型OATP1B1*1a;而OATP1B1*15(388A＞G 521T＞C)基因型个体与野生型OATP1B1*1a个体对ATV转运活性差异无统计学意义。CYP3A4*3(M445T) 及*5(P218R)突变型重组酶代谢ATV的活性大于CYP3A4*1野生型重组酶；CYP3A4*16(T185S)突变 型重组酶代谢ATV的活性显著低于野生型;CYP3A4*18(L293P)突变型重组酶代谢ATV的活性与野生 型相近。 结论 OATP1B1521位点可能是ATV转运的分子作用点，也是影响OATP1B1对ATV转运能力 的关键位点，突变型OATP1B1521T＞C对阿托伐他汀的体内转运活性能力降低；CYP3A4445、CYP3A4 218、CYP3A4185位点可能是ATV代谢的分子作用点，也是影响CYP3A4对ATV代谢活性的关键位点。 故在临床应用中应结合OATP1B1及CYP3A4突变情况指导ATV用药，将更具合理性。 关键词：阿托伐他汀；有机阴离子转运多肽1b1；CYP3A4；基因多态性；分子机制 1．3其他材料 CYP3A4酶：购自陕西北美基因有限公司，其酶蛋白含量及酶活性均已标定。 2方法 2．1ATV在不同基因型OATPlBl质粒中转运差异的研究 2．1．1溶液配制 液，．20℃保存，临用前进行稀释；瑞舒伐他汀标准品贮备液的配制：精确称取瑞舒伐他汀标准品17．4lmg， 以10ml DMSo配制成1739岫噍的贮备液，．20℃保存，临用前进行稀释。 2．1．2 HEK293T细胞样品的处理方法建立 采用冰醋酸．乙酸乙酯液液萃取法提取细胞中的待测样品。取100“l完成摄取实验的HEK293T细胞破 20000rpm7min离心10分钟后，取10山进样分析。 2．1．3ATV LC．MS分析方法建立 O．2 色谱条件：流动相：乙腈：水(含0．1％甲酸)=60：40(v，v)；流速：ml／min；色谱柱：ShiIlladzll PackVP—0DS 150111IIl×2．0 C18(5弘m rm)a 质谱条件：离子化方式：电喷雾离子化；采集方式：选择性离子监测；曲型脱溶剂装置温度：250℃； 加热块温度：200℃；CDL电压：25V；检测电压：．1．65 kV；检测方式：正离子检测检测离子【M．H】’： L／m证。 阿托伐他汀m尼559．40；内标(瑞舒伐他汀)m／z482．30；雾化气流速：1．5L／miIl；干燥气流速：2．O 2．1．4 ATV对HEK293T细胞毒性试验 接种于96孔培养板，培养24h后换液，实验组分别加入含ATV系列浓度的培养液，对照组和空白组只加 培养液，边缘空用PBs填充，每组设6个复孔，24h后每孔加入5mg／IIll的MTT20出，培养4h后吸弃孔 分溶解，用酶联免疫检测仪于波长490砌处测定其吸光度值，空白孔调零，记录各孔吸光度值。计算细胞 存活率：细胞存活率=(实验组吸光度值／对照组吸光度值)×100％。 2．1．5考马斯亮蓝法测定HEK293T细胞裂解液蛋白含量 分别加入1．0m∥ml的蛋白质标准溶液O、1、2、3、4、5pl，其余用蒸馏水补充，使样品总体积为5m， 然后在595m下比色测定(1h内完成)以标准曲线O号管做参比，在595nm波长下比色，记录吸光值， 以蛋白质含量(¨咖1)为横坐标，吸光值为纵坐标，绘出标准曲线，用于计算蛋白浓度值。 2．1．6