单克隆和混克隆细胞表达外源基因效率的比较.pdfVIP

单克隆与混克隆细胞表达外源基因效率的比较 刘燕，崔建涛，李文梅，邢蕊，吕有勇 (北京大学肿瘤医院暨北京市肿瘤防治研究所分子肿瘤学实验室，恶性肿瘤发病机制及转化 研究教育部重点实验室) 【摘要】在细胞转染实验中，为了获得高效表达特定基因的细胞，往往需要挑选单个克隆进行 后续实验研究：但是这一过程存在筛选周期长，得到稳定单克隆细胞株数量少，长期保存容易 丢失目基因等问题。我们通过对胃泌素干扰载体在真核细胞表达的研究，比较经G418抗性 筛选获得的混克隆细胞和单克隆细胞沉默胃泌素基因表达水平的变化。结果显示，混克隆细 胞胃泌素的干扰效率与单克隆细胞的干扰效率基本相同，混克隆细胞实验与单克隆细胞实验 比较，具有实验周期短，操作简单，结果可靠，细胞长期保存较稳定等特点。这一结果表明， 利用混克隆细胞进行生物学特性鉴定和后续基因表达水平的研究，实验的真实性高、实验周 期短、减少污染机会，这一方法优于挑选单个细胞克隆。 【关键词】混克隆细胞；单克隆细胞；干扰效率 分子克隆实验中，有时需要把外源性的DXA通过载体导入细胞，以便进行基因功能， 基因调控等方面的实验。这些研究要求外源基因稳定整合到宿主染色体的细胞中，即我们所 说的克隆化细胞。以往常用的方法是选择性标记，将携带外源基因的载体加上neo抗性基因， 用含G418的选择培养基筛选出有效表达外源基因的单克隆细胞。但实验由于周期过长，不 可控因素过多，往往鉴定不出有效的单克隆，最后无功而返。本研究以干扰胃癌细胞系 BGC823细胞中胃泌素基因的表达为例，构建了带有[1eo抗性的胃泌素干扰载体，转染入 BGC823细胞中，经G418抗性筛选建立稳定整合外源基因的混克隆细胞株和单克隆细胞株， 应用RT-PCR和免疫荧光的方法对两种克隆细胞内胃泌素的干扰效率进行比较。 方法 1．细胞培养 培养，至细胞数量生长至培养皿的40％～60％汇合。 18 写泌素干扰质粒 皿中可见100／f Ⅱ的混克隆细胞 二，又或老 实死亡。一 滗获得真工 -10为挑选的单费 mRNA的表达水平 ;ell.Mol.LifeScifi G6ke,etal.Knoct 2[J],Biochimicaet