布鲁氏菌PGM蛋白对细胞炎症反应影响.pdfVIP

中国畜牧兽医学会畜牧兽医生物技术学分会暨中国免疫学会兽医免疫分会第九次学术研讨会论文集 M蛋白对细胞炎症反应的影响 布鲁氏茵PG 张 辉，王 震，张 艳，张 豫，陈瑞花，孟 茹，张倩，陈创夫4 (石河子大学动物科技学院，新疆石河子832000) 的损伤作用及其引起炎症反应时细胞因子的变化，探讨布鲁氏茵pgrn基因的生物学功能。本文分别用布鲁氏茵 pgm基因缺失株和纯化的PGM蛋白感染胚胎滋养层细胞，通过细胞形态学的观察和酶联免疫反应检测其对细胞 的损伤作用以及细胞因子的变化。本实验获得了纯化的PGM蛋白，成功构建了pgm基因缺失株，采用该基因缺 失株免疫小鼠后，采集血液分离血清，虎红平板实验和试管凝集实验结果显示为阴性；pgm缺失株和PGM蛋白感 损伤，且引发滋养层细胞细胞因子的表达变化，为进一步研究布鲁氏茵感染宿主细胞的分子机制奠定了基础。 关键词：布鲁氏菌；磷酸葡萄糖变位酶(pgm)；HPT一8 布鲁氏菌病是由布鲁氏菌(Brucella)引起的一强的血清学反应，pgm基因的缺失可影响细胞壁及 种广泛流行、人畜共患的慢性传染病，是《中华人 其附件的合成，比如B环状葡聚糖的合成【6l。目前 民共和国传染病防疫法》规定的乙类传染病【11。人 pgm基因在布鲁氏菌感染过程中发挥的具体作用尚 感染后常表现为持续性感染，造成生殖系统的损 不完全清楚。因此，在本研究中我们选择pgm基因 害；动物感染后，公畜易引起睾丸炎，母畜易造成 作为目的基因，构建其原核表达载体并纯化重组蛋 流产【21。布鲁氏菌病在世界范围内广泛流行，严重 白，同时构建布鲁氏菌pgm缺失株，分别用PGM 危害着畜牧业发展和人类健康。因此，对该病的研 蛋白和pgm缺失株感染人胚胎滋养层细胞，通过酶 究一直倍受国内外诸多学者高度关注『3】。布鲁氏菌 联免疫反应检测炎症细胞因子水平的变化，分析 病的病原为布鲁氏菌，是一种革兰氏阴性兼性胞内 pgm基因对胚胎滋养层细胞的影响，为揭示pgm基 寄生菌【4】，主要定居在胚胎滋养层细胞和巨噬细胞 因在布鲁氏菌持续感染过程中的功能奠定基础。 这两类宿主细胞中。布鲁氏菌在这些细胞中表现出 很强的生存和繁殖能力，其在宿主细胞内寄生并能 1材料和方法 够逃避宿主的胞外防御机制，也能抑制细胞的免疫 机制，从而使细菌长期寄生在宿主细胞内，引起慢 1．1 材料 性感染，但其分子致病机制至今仍不是非常清楚。 1．1．1 细胞、菌株和质粒人胚胎滋养层细胞 布鲁氏菌不分泌外毒素，脂多糖(LPS)在维持布 鲁氏菌外膜结构完整和稳定方面起着重要作用[51， 均为本实验室保存，大肠杆菌E．coliDH5a和大肠杆 是公认的布鲁氏菌主要毒力因子。磷酸葡萄糖变位 菌E．coli 酶是布鲁氏菌装配形成LPS的必需酶。完整的脂多 sim- 糖作为布鲁氏菌的优势抗原，能够刺激机体产生很 -216一 中国畜牧兽医学会畜牧兽医生物技术学分会暨中国免疫学会兽医免疫分会第九次学术研讨会论文集 由本实验室保存。 质粒，用PCR方法和EcoRI及SalI双酶切鉴定。鉴 1．1．2 DNA聚合酶、dNTP、定正确的质粒再次送华大基因测序。 主要试剂Taq Ni—NTA纯化试剂盒和BCA蛋白质定量试剂盒均购1．3．2表达质粒转入BL21表达茵鉴定正确的质 自天根生化科技有限公司；DNAMarker、限制性内粒转化E．coli I及SalI双 进行培养，提取质粒，用PCR方法和EcoR 切酶、pMDl8．TSimple连接试剂盒均购自TaKaRa 公司；小量质粒提取试剂盒、琼脂糖凝胶DNA回 酶切鉴定。 收试剂盒购自上海捷瑞生物公司；琼脂糖、蛋白 1