抗凋亡基因Survivin具有促进细胞恶变作用.pdfVIP

抗再亡基因酬佃具有促进细胞恶变的作用 抗凋亡基因Survivin具有促进细胞恶变的作用 朱红霞刘爽用晓波周翠琦垒兰平徐宁志 细胞增殖与凋亡是细胞生命中两个必需而又相对立的过程，二者的动态平衡是细胞正常 生长和行使功能的保证。一旦失衡就会引起病变。在恶性肿瘤中就经常可以见到增殖通路的 不正常激活和凋亡通路的失活”1。 IAP家族是一类分布广泛的抗凋亡基因，可抑制由多种刺激引起的凋亡，在细胞的正常生理 活动中起重要作用旺】。但最近发现的一个新的家族成员Survivin却使抗其与肿瘤的关系大大拉 近。survivin是IAP家族分子量最小的成员，只有16 特异性，在正常的成年组织不表达而在多种肿瘤中表达，而且Survivin的表达与肿瘤的恶性程 度及病人的预后密切相关o。】。进一步的研究表明，Survivin反义核酸及显性负突变体可以引 起细胞周期的异常和凋亡过程”’7J。这些都表明Survivin在肿瘤的发生发展中具有重要作用。 基因蛋白水平的增高，这也是其它抗凋亡基因所设有的功能，这些都进一步说明Survivin在肿 瘤形成中可能具有更重要的作用。 材料与方法 l一)重组质粒的构建 I和Xho 合成分别带有BamH 细胞的mRNA为模板，RT—PCR扩增Survivin的编码区421 bp。酶切后连接到P(；EX一4T一3一 端以99位氨基酸为界分别克隆到CFP—N1中。 (二)原核表达 mol／L，继续 含空载及Surfivia基因的菌株，培养至对数生长期，加入IPTG至终浓度为1．5 培养3—4 斯蓝染色。用GST一4B纯化得到相对纯度较高的C．ST—Survivin融合蛋白。 (三)真核细胞的培养及转染 HEK 293细胞，NIH 作者单位l(J0021北京，中国协和医科大学中国医学科学院肿瘤研究所细胞生物与分子生物学实验室 中目癌症研究进展⑥ lipofectamine每孔1腭DNA转染细胞，48h提蛋白，稳定株利用400 d后即可得。 v#na培养10 {四)生长曲线的绘制 生长状态良好的细胞，消化后制成悬液，接种24孔板，每孔3x104细胞，放置37℃培养， 隔天计数细胞，取3个孔的均值。 (五)田嚣一PAGE及WesternNot nmaol／L 细胞用蛋白裂解液[20nenol／L1豳·cl(pH8．0)，137NaCI，20mmol／L胛r，1％NP一 rmnol／Lsodium 40，2 PMSF，1 rain， vanadate，100wg／mlvg／mlaprotinin】悬浮细胞，冰浴处理30 12000 r／rain离心10 聚丙烯酰胺分离胶电泳，半干式转移法转至硝酸纤维素膜。用5％的脱脂奶粉封闭后，使用相 应的抗体杂交后，用lmminol方法显色。 结 果 (一)重组质粒的构建和鉴定 双酶切后连接得到的阳性克隆用酶切鉴定，经测序证明与GeneBank中序列完全符合。由此得 GFP标签。 (二}原核表达Survlvin的GST融合蛋白 kD 用原核表达的蛋自制备Survivin的抗体，也有很好的效价“]。 (三)细胞生长曲线 在统计学上均无显著性差异。 (四)SoftAgar结果