基于细胞影像的中药注射剂高内涵肝毒性检测方法建立和其对四种常用中药注射剂的应用.pdfVIP

第二届岐黄论坛大会报告及论文选编 基于细胞影像的中药注射剂高内涵肝毒性检测方法 建立及其对四种常用中药注射剂的应用 王萌，刘辰翔，董冉冉，贺爽，赵铁禅，王志龙，申茜娅，张伯礼，高秀梅，朱彦+ 天津中医药大学，天津市现代重点实验室．省部共建国家重点实验室培育基地， 现代中药发现与制剂技术教育部工程研究中心f天津300193) Operetta高内涵筛选系统，以细胞数目、 【摘要】本研究采用人源HepG2细胞，采用PerkinElmer 33342、 细胞核面积、线粒体质量、线粒体膜电位、血浆膜通透性作为检测指标，分别采用Hoechst MitotrackerRedFM、Rodamine123、PIiodide四种荧光染料标记不同细胞结构，选择三种机理 Deep 明确的具肝毒性药物乙酰氨基酚、FCCP、盐酸阿霉素为阳性药，建立一种基于细胞影像学的多指标 高内涵分析方法来研究中药注射剂的肝毒性。采用此方法对四种具不同程度肝毒性不良反应报道的 参注射液(FFKSI))，并采用28天亚急性动物毒性实验对结果进行验证。四种中药注射剂中，XDI 剂量组线粒体膜电位均降低。结果表明FFKSI各剂量组和高剂量的XDI损害HepG2细胞的线粒体 引起肝细胞损伤。高内涵评价结果与动物亚急性试验结果保持一致，所建立的方法适用于中药注射 剂等复杂体系肝毒性研究，为中药临床前药物筛选和上市后安全性在评价提供技术支持。 【关键词】中药注射剂；高内涵分析技术(HCA)；HepG2细胞；肝毒性 中药注射剂是一种新颖的、可快速起效的中药剂型，在临床急重症治疗中具有重要 应用前景和实际意义。然而由于近期其不良反应报道的增加，中药注射剂的安全性备受 关注。中药注射剂引起的不良反应占中药不良反应总数的77．2％[1]，其中以肝毒性最为 常见[2]。在西方国家药物引起的肝毒性占急性肝功能衰竭案例的一半[3]。传统的研究药 物肝毒性动物实验效率较低，在大量耗费动物的同时存在约一半的假阴性率【钔。针对药 物肝损伤，特别是中药复方复杂体系的肝毒性研究，本研究旨在建立一种方法更为准确、 快速、高通量地评价方法。 高内涵分析技术(HCA)是一种重要的、运用多探针实现荧光显微镜定量分析和自 动化图像分析的细胞损伤凋亡预测和评价工具。高内涵分析技术可以实现对细胞凋亡过 程中多个细胞生物标记物进行同时体外实时监测【6】，目前己越来越多地应用于基因毒 +基金项目：天津市高等学校创新团队(TD2—5031) ．．334．． 第二届岐黄论坛大会报告及论文选编 性、肝毒性等检测和机制研究中[7】。中药注射剂由于其物质基础尚不完全明确，为其毒 性评价，尤其是其作用机制研究带来较大影响，高内涵分析技术具有的直观性、可视性、 多参数性为评价中药注射剂等复杂体系的肝毒性提供了可能。 本研究选用的四种注射齐¨一丹红注射液(DⅢ)、香丹注射液(xDI)、脉络宁注射液 品种，销售额约为四百万人民币。但近年来针对四种中药注射剂有不同程度不良反应报道 临床观察发现多例DHI和FFKSI可以增加AL工AST和ALP的含量[11．15】。 本研究旨在建立一种基于细胞表型的具有实用性、重现性、多指标的高内涵分析方法 用以评估中药注射剂的肝毒性从而揭示其毒性机制。本研究采用人源HepG2细胞[16q8]，以 三种不同毒性机制药物FCCP、对乙酰氨基酚和盐酸阿霉素为阳性药119-22]，优化不同荧光 通道以检测与肝毒性相关的细胞数目、细胞核面积、线粒体质量、线粒体膜电位、血浆膜 毒性进行评价，并采用28天亚急性动物实验对实验结果进行验证。将动物死亡率、生存 和GSH)等指标与高内涵分析结果作比较，对所建立的方法进行优化和验证。 1材料和方法 大连)；四种注射剂：丹红注射液(DHI，步长制药有限公司，中国山东)、香丹注射液 (XDI，拜肯制药有限公司，中国江苏)、脉络宁注射液(MLNI，金陵制药有限公司， 中国江苏)、复方苦参注射液(FFKSI，振东制药有限公司，中国山西)均购白天津中 医药大学第一附属医院。HepG2细胞购自中国科学院典藏委员会上