显色基质法定量测定质粒DNA中的细菌内毒素.pdfVIP

维普资讯 第 25卷 第 4期 石河子大学学报 (自然科学版) V01．25 No．4 2007年 8月 JournalofShiheziUniversity(NaturalScience) Aug．2007 文章编号：1007—7383(2007)04—4053—03 显色基质法定量测定质粒 DNA中的细菌 内毒素 向春和 ，宋志强 ，皮文辉 ， (1石河子大学动物科技学院，新辐石河子 832003；2新疆农垦科学院畜牧兽医所，新疆石河子 832000) 摘要：探讨使用显色基质法定量测定质粒 DNA中细菌内毒素含量的可行性。结果表明，质粒 DNA溶液经 2倍稀 释，对内毒素检测不存在干扰作用，用显色基质法可以定量测定质粒DNA中内毒素含量。显色基质法与家兔热源 法比较，有敏捷、快速 、定量、稳定可行的优点，其测定结果同家兔热源法结果一致。 关键词 ：质粒DNA；显色基质鲎试剂法 ；细菌内毒素；干扰试验 中图分类号：$852．61 文献标识码 ：A 近几年，建立在 DNA基础上的基因治疗和DNA 厂有限公司，该检测试剂盒内毒素的检测灵敏度为 疫苗 已经成为一个研究方 向。对生物体运用质粒载 0．005EU／mL。细菌内毒素工作标准品批号：050603， 体与病毒载体相 比，质粒载体具有免疫源性低 、安全 规格 ：15EU／支，冻干粉 ；鲎试剂批号：060920，规格： 和容易制作等优点。质粒 DNA的宿主菌为大肠杆 0．5ml／支，冻干粉 ；细 菌 内毒 素检测 用水批 号： 菌，从细菌发酵产物 中提取 。传统的阴离子交换色 060606，规格 ：50mL／瓶 ；显色基质批号 ：060503，规 谱纯化质粒 DNA中，残存了相当数量的内毒素。内 格 ：1．5mL／瓶，冻干粉 ；偶氮化试剂 1、2、3批号分别 毒素将造成炎症或坏死等副反应。因此，在使用质 是：060507、060508、060509，规格 ：10mlM瓶 ；HCL(反 粒 DNA进行活体动物实验之前，有必要对质粒 DNA 应终止剂)批号：060426，规格 ：50mL。 制品的内毒素含量进行监控。 使用生理盐水溶解的pS。GRF质粒 DNA由本教 鲎试剂法作为一种检测疫苗制品细菌内毒素方 研室纯化制备，取3批经家兔热源法检查合格样品 法已被列入 《中华人民共和国药典》川I。显色基质法 (批号 20061103、20061ll0，含量 1mg／mL) 是依据反应混合物中内毒素浓度和其在孵育终止时 进行检测。 释放出的呈色团的量之间存在的量化关系来测定内 1．1．2 主要器材 毒素含量的方法。这种方法抗干扰能力强，重复性 超净工作台(型号SZX，上海浦东跃欣科学仪器 好 ，稳定性强 ，灵敏度高。 厂)；电热恒温水浴箱(汕头市医疗器械二厂)；漩涡 陈祖欢等l2l用凝胶法检测 DNA疫苗的细菌 内 混合器(XW280A型，上海医科大学仪器厂)；752型 毒素。但 目前国内未见采用显色基质法测定质粒 紫外分光光度计 (北京中仪金叶科技有限公司)。 DNA内毒素含量的报道。因此，本实验尝试采用鲎 实验中所有器皿都必须是无热原的。玻璃器皿 试剂显色基质法测定质粒 DNA内毒素含量，以确定 经 250~C干烤 2h去热原，吸头为无热原塑料制品。 鲎试剂定量测定质粒 DNA中内毒素含量是否可行 1．2 方法 或有干扰作用，为质粒 DNA的质量检测提供依据。 1．2．1 标准 曲线的可靠性试验 1．2．i