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转TaLEA小黑杨矮化突变体机理研究 陈肃 (东北林业大学) 摘要：本实验室通过农杆菌介导法将TaLEA基因(DQ663481)转化到小黑杨花粉植株中，获 得了11个转TaLEA小黑杨独立转化株系，研究过程中发现了一株显著不同于其他转TaLEA 小黑杨的矮化突变株(将此株系暂命名为dwfl)，通过生长性状、叶片解剖结构比较发现， 在叶面积、气孔密度、叶片厚度等方面转基因XLll株系明显低于其他参试株系：角质层厚度、 栅海比，气孔大小等方面XLI l株系显著高于其他参试株系。为深入研究dwyl的抗盐机理及 突变表型的分子机理，本研究分别在DNA、mRNA以及蛋白三个水平对dwfl进行了研究。 采用TAIL．PCR方法克隆插入位点的旁侧序列得到AP2基因。荧光定量分析发现彳户2基 因的相对表达量在dwfl中显著高于其他转基因株系及野生型，dwfl突变性状是否是由于该 基因的上调表达引起的，还有待进一步的功能验证。 对dwfl4黑杨突变株与野生型对照进行TAffymetrix微阵列芯片的差异转录表达谱分析。 筛选出差异基因537个，其中280个基因上调表达，257个基因下调表达。这些差异基因中除43 个功能未知或未分类的基因外，其他基因分为ll类，包括代谢、胁迫、蛋白合成及降解、激酶、 细胞壁、激素、信号转导、转录调控、运输、细胞结构基因及细胞命运等。通过分析发现， ehalcone S-transferase、WRKY、bZIP、 glucanase、peroxidase、synthase，glutathione AP2／EREBP、NAC、serine／threoninekinase，stress—induced transfer receptor-likekinase、lipid protein等都上调表达。在正常生长条件，这些胁迫诱导表达基因的高量表达Y可dwfl的耐盐性提 AIL5、JAZl0等的表达水平也发生了显著变化，推测这些基因的变化很可能影响了激素的水平， 进而影响了植物的生长发育，从而导致了dwfl植株矮化等的表型。 LC 利用无标记定量分析(Label—free MS／MS)的方法对dwfl小黑杨突变株与野生型对照 进行了差异蛋白表达谱分析，共筛选出99个差异表达的蛋白，其中上调表达蛋白32个，下 调表达蛋白17个，dwfl中特异表达蛋白33个，野生型中特异表达蛋白17个。在99个差异 蛋白中，除15个蛋白未能分类外，其它蛋白共分为8大类：代谢、胁迫、蛋白折叠、加工、降 解、转录调控、细胞命运、运输、细胞壁及细胞骨架。将无标记定量分析的结果与Affymetrix 微阵列芯片结果进行比较发现，在糖酵解、肌醇磷酸代谢、氮代谢等代谢通路中的差异基因， mRNA和蛋白质丰度差异基本吻合。而信号转导、转录因子、激素及核糖体蛋白、转录起始 因子等相关基因的mRNA与蛋白质丰度差异显著。差异转录表达谱与差异蛋白表达谱的不一 致性为今后对抗逆基因转录后调控机制的研究提供了重要线索。 451