猪骨骼肌单根肌纤维分离、培养方法建立.pdfVIP

·扬州· 第十六次全国动物遗传育种学术讨论会论文集 ·171· 猪骨骼肌单根肌纤维分离、培养方法的建立 刘月光，史新娥，沈清武，杨秋梅，陈宗正，高晓娟，杨公社’ (西北农林科技大学动物科技学院， 动物脂肪沉积与肌肉发育实验宣，陕西杨凌712100) 引青 骨骼肌由肌纤维组成，动物出生后，肌纤维数量一般保持恒定不变，肌肉生长主要依赖于肌纤维体积的增大。骨 骼肌卫星细胞是位于肌纤维膜与基膜之间的肌源性干细胞。通常以静息状态存在，当受到外界刺激(生长、远动、损伤 等)时。就会被激活，进而增殖、分化、融合形成多核肌管。由于分离、培养单根肌纤维能维持卫星细胞与肌纤维之间的 相互联系，消除非肌肉细胞的影响，是研究肌肉再生过程中卫星细胞静息、激活、迁移和增殖等的重要模型。近年培养 单根纤维已成为研究热点之一，但在大动物(如猪)上的研究尚未报道。因此，本研究旨在建立一种培养猪骨骼肌单根 肌纤维的方法，为骨骼肌的再生机理研究提供技术平台。 材料与方法 以1—3日龄健康大白猪为实验材料，电击处死，在无菌操作台上小心剥离猪趾长伸肌(ExtensorDigitorum min，待整个肌肉块呈松散状时．转移至马血清涂渍的玻璃皿中，用广口吸管反复吹打，若肌纤维仍粘连在一起，则继 续消化数分钟，直至有大量的肌纤维游离出来，选择完整未受损的单根肌纤维，用细口弯头吸管小心的移人另外的玻 璃皿中，洗3次，随后以1根／孔的密度接种于24孔板中，于37℃、5％CO：培养箱中培养。培养24h后。通过形态学观 察、免疫荧光染色和细胞迁移率等方法进行分析。 结果 将分离获得的完整单根肌纤维置于增殖培养基中培养24h，倒置显微镜下观察，肌纤维上有许多凸起。同时有少 量细胞从肌纤维上迁移出来。培养48h后，可见有大量细胞迁出，呈球形，折光性强。培养72h后，游离出来的细胞逐 渐开始贴壁，并由圆形变为梭形或纺锤形。培养3-4d后，大部分细胞贴壁并开始大量增殖。Pax7是鉴定肌卫星细胞的 察到有少量附着于肌纤维上的细胞呈阳性；培养3d后。从单根肌纤维上游离出来的细胞Pax7免疫荧光染色也呈阳 性。以上结果表明，本研究成功建立了单根肌纤维的培养方法，并证明其上附着的细胞为卫星细胞，且具有较高的活 力，检测游离出来并贴壁细胞纯度达到90％以上。 讨论与结论 分离、培养单根肌纤维要求获得的肌纤维完整无损。与啮齿类动物相比，猪的肌肉组织体积较大，不易整块消化， 趾长伸肌由四束肌睫组成，可以剥离成完整的四小块，易于消化酶快速充分消化。同时，骨骼肌卫星细胞的数目随年 龄不同而变化，一般来说，年幼个体的骨骼肌卫星细胞含量较为丰富。因此，选取1-3日龄猪趾长伸肌作为单根肌纤 et and (Lina1．，2007；Perry 立了骨骼肌单根肌纤维的培养方法。同时还获得了高活力，高纯度的骨骼肌卫星细胞．为今后猪肉品质和肌肉再生机 理研究莫定基础。 关键词：骨骼肌纤维；卫星细胞；Pax7；猪 致谢：本研究由转基因生物新品种培育重大专项(2009ZX08009-157B)资助。 奉通讯作者。