猪TCAP基因启动子克隆和活性分析.pdfVIP

90 ofthe12mNational onAnimalGeneticMarkers Proceeding Symposium 猪几疆P基因启动子克隆及活性分析 武华玉1，黄京书1乔木2，彭先文1，冯政1，梅书棋1 (1．湖北省农业科学院畜牧兽医研究所，武汉430064；2．华中农业大学动物科技学院，武汉 430070) 引言 TCAP基因编码的蛋白是一种在横纹肌和一C,,PJL中特异性表达的蛋白，是肌联蛋白激酶的 作用底物，它绑定于肌联蛋白Zl-Z2区，通过连接和支撑肌联蛋白为其它肌纤维蛋白提供 空间上固定的结合位点，从而在调节肌原纤维的组装中起到重要的作用。除了在肌原纤维的 组装中扮演重要角色之外，孔M尸还对肌原纤维的翻转起着重要的作用，研究发现TCAP 基因与肌肉萎缩和心肌症有关。TCAP基因由2个外显子和1个内含子组成，在人和鼠中， TCAP基因编码167个氨基酸。黄京书分离克隆了猪的TCAP基因，并未对其表达调控做进 一步研究。本研究采用PCR方法克隆猪TCAP的启动子序列，采用荧光素酶报告系统研究 TCAP的启动子不同区段的转录活性，为研究研究TCAP基因转录调控机制奠定了基础。 材料与方法 根据Proscan启动子预测软件预测结果以大白猪基因组DNA为模板扩增只麓尸基因的 2．5mmol／L、1．5mmol／L mmol／LdNTPs、0．5mmol／LPCR U MgCl2、2．5 primers、2TaqDNA min；94℃45s，62℃40s，72℃90s， 聚合酶(MBI)，PCR的运行程序如下：预变性94℃4 35个循环；最后72℃继续延伸10min。纯化的上述PCR产物经XhoI和MluI酶切后连接 到pGL3-basic载体中转化大肠杆菌DH5a，提取转化质粒经双酶切和测序鉴定，转染猪肾 PK细胞，在HTS7000多孔板阅读器上读取荧光素酶活性活性，确定启动子不同区域转录活 性。 结果 通过荧光素酶活性测定表明在PK细胞中，与阴性对照pGL3．Basic空载体相比，7个 不同缺失片段重组质粒的转录活性提高了60—130倍，证明7个不同缺失片段重组质粒均具 有转录活性。插入片段长度为155bp的质粒转录活性最高，说明TCAP基因启动子核心区域 位于一155区域内。 讨论 启动子区的克隆是对基因表达调控进行研究的必要条件，通过启动子研究，许多新基因 功能及其在信号传导中的地位渐被认识。TCAP基凶是调控肌原纤维组装的重要调控基因之 一，对肌原纤维的翻转起着重要的作用，此外还与肌肉萎缩和心肌症有重要关系，该基闶的 表达特征和表达水平是如何受到调控的值得深入研究。根据软件预测结果与重要转录因子结 合位点构建了7个缺失片段载体，确定报告系统在PK细胞中有转录活性，研究结果显示该 基因的核心启动子区域位于一155区域内， 这与Proscan软件 动子报告系统的方法是可行的。为研究其他新基因的启动子转录调控机制提供了一种准确可 靠的荧光报告系统的构建方法，为进一步研究不同截短体启动子Ⅸ域的活性和确定转录调控 结构域、深入研究转录调控机制奠定了基础。