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蛋 白 質 體 學 生科四 王昌恩 488340107 主題： Plasmid display 簡介： Plasmid display利用據附著能力的材質作分析，在這個方法中使用一個DNA附著蛋白和質體DNA間蛋白質和DNA序列的非共價結合，第一個被利用的DNA蛋白是乳糖抑制子，乳糖抑制子由Lac I基因所表現出來，並緊密的結合在特定的DNA序列上lac O，就如同下圖所表示，一個108具有12個胺基酸所組成的 Peptide library去和乳糖抑制子的C端去做融合，藉著選殖質體pMC5下遊的lacI基因並包括了並排的lacO基因，在細胞內這個質體會直接合成乳糖抑制子和12個胺基酸序列組成的小段peptide，緊接著會形成4隅體的形狀，去附著在質體上的lacO的位置上，在打破細胞後，這一段peptide和質體的複合物利用具有選擇性的免疫抗體將特定的peptide - plasmid複合體給選質出來。 fig.1 Plasmid display 技術動機： 在這一個方法中，peptide會展現多價的形式，在乳糖抑制子中，以4隅體的形式附著在DNA後，每一個質體附著上兩個4隅體，因此這一個方法對於選殖低到中附著力的附著物是非常適合的，Gates等人更發展出一個乳糖操作組headpiece 雙隅體作用DNA附著的區域，這個headpiece 雙隅體可以呈現出較少的peptide library 數目，因此更適合去選殖出高附著力的附著物，儘管DNA附著的在headpiece 雙隅體的機制上不是很清楚，但這一個方法的peptide library會受限於DNA轉型進入細菌內的效率。 1997年Cwirla等人的報告中指出，其成功了分離了一個對thrombopoietin受器的nanomolar peptide的競爭物，依照我們有興趣的觀點來看，作者不僅使用了peptide on plasmid也使用了phage display和 ribosome display，它使用的是VIII的phage display、ribosome display和乳糖抑制子利用各種不同的展示方式，更進一步增加了IC50s由20mM到60nM，然而他使用了更進一步的區間為IC50s由20mM到60nM peptide突變株，然而他使用headpiece 雙隅體方式被授命為高附著力的peptide，AF12505，具有2nm的IC50s，這個AF12505的雙隅體展現出了0.5nm的IC50s，具有可以作為人類重組凝血因子的潛力，儘管回顧者並不清楚，但是這這個作者定論peptide on plasmid選擇上是在生成高附著性peptide附著物最具有效果方法，其應用的重要性是可以利用高價的分子來做peptide的附著，高的價數可以在早期附著一些低附著性的附著物，然而如果已經知道這個附著體是屬於高附著的這樣我們僅需要使用低價數的分子即可以挑選。 參考資料： Hening Lin(2002) Screening and Selection Methods for Large-Scale Analysis of Protein Function , Angew. Chem. Int. Ed, 41, 4402 - 4425 主題：Spatially Addressable Methods 前言： Spatially addressable的方法，，，可以去測量抗體和抗原間的結合，， fig1.微量滴定盤的使用20/~juang/BCT/Chapters/Chap4-2.htm) ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)： 酵素連結免疫分析法已，因為非常靈敏且不必如免疫螢光術和放射免疫分析法需要特殊設備。此法的原理是以一種酵素連結到抗原或抗體上，用酵素活性來做為定量標記。有許多方法已經架構完成，視使用的酵素性質及待測的抗原-ELISA是在1971年首次由Engvall和Perlman所介紹。 不論是測抗原或抗體都有很高的敏感性及專一性，且使用設備相較之下少了許多。固相吸附准許unbound reagents若要測定抗原，則以一已知特定抗體結到固相之上，含有抗原之待測物加入後，沖洗掉多餘部分，再加入第二種有酵素標記的抗體。此試驗中的抗原至少要有二個決定部位。洗去第二種抗體後，加入基質，用色度計估計酵素活性，此濃度與抗原濃度有關。偵測AgAntibody sandwich immunoassay（即加入Ab再加Ag最後是Ab）及Antibody capture immunoassay（Competition assay）。我們要談的是抗體三明治免疫分析法：首先是Ag專一性的primary Ab的吸附到塑膠盤，此時洞被