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HPLC 分析方法开发与验证 分析方法开发与验证在不同行业有不同的要求，医药化学行业对于质量的控制非 常严格，高效液相分析是控制产品质量的重要手段，其开发与验证对其它行业有 很好的借鉴意义。 一、分析方法开发 分析方法的开发主要包括色谱柱的选择、流动相的选择、检测波长的选择和梯度 的优化几个方面。目前高效液相多做反相使用，所以本文主要以反相为例进行讲 解。 1.色谱柱的选择 原料药生产对产品的纯度和杂质含量的要求非常苛刻，要求检测使用的色谱柱有 较高的理论塔板数，能提供更好的分离度，从而对可能存在的杂质有更大的分离 的可能性，所以5um 填料的色谱柱长要250mm ，3.5um 填料的柱长要150mm， 基本上都是各个粒径柱长最长的。我比较喜欢近两年新出的亚二微米填料的色谱 柱，50mm 柱长就能提供很高的理论塔板数，而且柱长和粒径小了，流速增加很 多，能节省很多的分析时间，极大的提高工作效率。一般选用直径为4.6mm 或 3.0mm 的柱子，太细了可能会增大柱外效应。填料的孔径对于小分子合成药物不 需要考虑，普通的分析柱都在100A 左右，能满足分析检测的需要。 对于 API 分析方法开发，一般要求必须做色谱柱的筛选实验，最少使用三种不 同类型的色谱柱，每种类型三只，要来自于不同厂家。 三种类型包括： 1)普通的C18 或相应的C8 色谱柱，如Waters 的Symmetry C18 或C8，YMC 的 Pack Pro C18 或C8，Agilent 的RX C8 等，其它公司如菲罗门和热电也有相应的 色谱柱； 2)封端处理的或者极性嵌入型色谱柱，如Waters 的Symmetry Shield RP18 或RP8 ， XTerra RP18 或RP8 ，YMC 的ODS AQ，Agilent 的Zorbax SB AQ 等，其它公司 如菲罗门和热电也有相应的色谱柱； 3)填料用其它官能团修饰过的色谱柱，如苯基柱等，很多公司都有。 一般不同类型的色谱柱在选择性上会有很大的差异，相同类型的色谱柱生产厂家 不同在选择性上也会有差异，这个主要是填料的性质和生产工艺决定的，有时候 用一只色谱柱分离不好，除了优化梯度和流动相外，换一个厂家的柱子也是一个 很好的选择。相同品牌型号的色谱柱，C18 和C8 在选择性上没有差异，但是C18 保留能力更强，相同的样品分离度更高，我们一般倾向于选择用C18 。我们在筛 选色谱柱时尽量选择行业内排名前几位的厂家，柱子品质好，开发分析方法时能 省很多力气，做出来的分析方法也有保证。一个药从开发到上市可能会持续十几 年甚至更长时间，厂家有实力，开发方法时选定的柱子在若干年以后需要时还会 有的买，做分析时重复性也能保障。多用几只色谱柱做筛选和分析方法优化，能 尽最大的可能提高分析方法的质量，保证检测结果的可信度。 我比较喜欢用的柱子有：Agilent 的Zorbax Eclipse XDB-C18 、Zorbax Eclipse Plus C18，Waters 的Symmetry C18、XTerra RP18 、XTerra MS C18 等，YMC 的柱子 有时会是不错的备用选择，菲罗门的柱子菲罗门的柱子国内外市场占有率较高， 但是感觉柱子压力高，寿命短，尽量不用，热电的柱子用的也不少，但没什么感 觉。 制剂分析方法选择色谱柱的要求基本和 API 相一样，对于中间体和生产过程中 反应跟踪（IPC ）分析方法开发使用的色谱柱，我们一般会根据样品性质直接选 取一两只普通C18 或者封端处理过的色谱柱，简化筛选过程。 2.流动相的选择 常用做反相流动相的溶剂是甲醇和乙腈，甲醇有其性价比的优势，但是甲醇活性 高，可能与某些样品发生反应，而且甲醇在低波长下有紫外吸收，会降低分析方 法的灵敏度；乙腈虽然价格很高，毒性比甲醇大，但是洗脱能力比甲醇强，很少 与样品发生反应，用作流动相系统压力要比甲醇低很多，且截止波长比甲醇低 20nm ，增加了检测出在低波长下才有吸收的杂质的可能性，所以我们一般倾向 于多用乙腈，少用甲醇。但是有时候样品峰形不好或者分离不好，更换溶剂试试 是一个很好的选择，毕竟不同的溶剂提供不同的选择性。 对流动相的优化主要在水相上下功夫，水里可以加酸、加碱、加盐，从而改善峰 形、提高分离度。流动相里加碱的情况比较少，主要还是加酸，常用的酸有磷酸、 三氟乙酸、甲酸、乙酸、高氯酸、甲基磺酸等，其中最常用的是磷酸和三氟乙酸， 磷酸在低波长下没有紫外吸收，而三氟乙酸在低波长下有，但是三氟乙酸易挥发 而磷酸不行，所以单纯做液相，低波长下磷酸最