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· 72· MedicalLaboratoryScienceandClinics，2014，Vo125，No．3 医学检验与临床 2014年第 25卷第3期 基于液相芯片技术的呼吸道病原体 多重检测技术的建立 袁勤芬 。 尹飞飞 王华林 刘万红 1(武汉大学基础医学院，湖北武汉，430071) 2(中国科学院武汉病毒研究所，湖北武汉，430071) 呼吸道感染是临床最常见 的疾病之一，可由多 1．1材料与试剂 种病原体引起，包括细菌、病毒、支原体、衣原体 1．1．1病毒与细胞株 等，其临床表现与治疗因病原体不同而存在较大差异 选取常见多发的呼吸道合胞体病毒 (RSV)、流感 (I-4) 。 研究表明95％的急性上呼吸道疾病和大部分的 病毒A型 (INFA)、流感病毒B型 (INFB)和副流感 下呼吸道疾病均由细菌外的病原感染引起，其中以呼 病毒 (PIV)等作为检测对象。所有阳性对照病毒和 吸道病毒最为常见，包括呼吸道合胞体病毒 (respiratory veto、MDCK等宿主细胞株均由本实验室保存。 syncytialvirus，RSV)、腺病毒 (adenovirus，ADV)、流感 1．1．2试剂与仪器 病毒 A型 (InfluenzavirusA，INFA)、流感病毒 B型 病毒RNA提取试剂盒、一步法RT—PCR试剂盒 (InfluenzavirusB，INFB)、副流感病毒 fparainfluenza 购 自Qiagen公司、链合青霉素标记的藻红蛋白(SAPE) virus，PIV)等 一。大部分呼吸道病毒具有感染力强、 购 自Millipore公司，Taq酶购 自Takara公司，微球 、 传播快、潜伏期短、发病急等特点，并且新致病性病 luminex检测仪购 自luminex公司。 毒还在不断被发现。据统计，呼吸道和胞病毒、甲型 1．1．3检测标本 流感 、乙型流感和副流感病毒是呼吸道病毒感染中最 l4份医院来源疑似呼吸道病毒感染咽拭子由本室 常见的病原体，占病毒感染种类的90％，致死率8％ 收集和一80~C冻存。 左右，严重危害到公众的健康和安全 (7)。因此，建立 1．2方法 一 种快速准确的诊断方法 ，不仅有利于病因确诊 ，也 1．2．1寡聚核苷酸探针的设计与合成 有利于临床采取针对性治疗 ，同时在病毒的流行病学 根据GENEBANK中呼吸道合胞病毒、流感病毒 调查以及阻止病毒的传播与扩散中具有重要的作用。 A型和B型以及三种亚型的副流感病毒核酸序列，利 扩增子拯救多重PCR检测技术是近年来发展起来 用Bioedite、primer等生物学软件对核酸序列进行比对 的一种崭新的扩增策略，即利用两步反应同时对多个 后，针对保守区域进行PCR引物和探针的设计 ，其中 靶点进行扩增 ：第一步反应采用巢式基因特异性引物 上下游引物的5’端加入不同的通用接头序列 (5’一 富集核苷酸，并把标签引人扩增产物 ；随后采用生物 通用序列一病原体特异性序列 一3’)用于第二轮PCR。 素标记的通用引物对带有标签的产物进行 PCR扩增和 所有引物和探针均由Invitrogen公司合成。引物和探针 标记 ；最后利用 Luminex多重液相悬浮平台检测得到 序列结果如表 1所示。 的产物。本文中，我们选取了呼吸道疾病中主要的四 1．2．2病毒培养和核酸提取 种病毒作为检测 目标，采取扩增子拯救多重PCR扩增 呼吸道合胞体病毒感染 vero，流感病毒A型、流 技术，结合LuminexxMAP检测平台，构建了一