生物素标记贾第虫全基因组DNA探针的制备及其特异性敏感性测定.pdfVIP

维普资讯 ‘ 0 动 物 学 研 究 1994， 15 (1)：85 90 CN 5}l040／Q ISSN 0254—5853 ZoologicalResearch 生物素标记贾第虫全基因组 DNA探针的制备 及其特异性敏感性测定 卢思奇 闰 歌 王凤芸 ．_ _ 【_尚_-都--版学．--院寄 虫学教研摩 100054) 摘要 用牛物 素标记的贾第虫全基 因组 DNA探针，在斑点杂交试骑中显示高度 的敏感性和特异性 用它可榆出 IOng贾第虫 DNA，10个贾第虫滋养体或包囊，且 不 道毛滴虫、溶组织内阿米 巴 弓形虫和 BABL／c小鼠肝细胞 DNA，以及贾第 虫患者粪便 上清液发生交叉反应。车探针可用于贾第虫病病原体检测和虫株 鉴定研 … 盥 关键词-墼拿箱堡…生斑点杂…交试骑骑身蚰 近年 ，国外 已将 DNA探 针技术用 于贾第虫 Giardia 的虫株鉴定 (Archibald等 ， 1991)和病原体检~U(Lewis等，l990；Butcher等，1989)。在贾第虫的此类研究中，以往 使胴的探针多用基因组或重组 DNA标记 以放射性物质(如 P)制备的。而用非放射性物质 (如生物素)标记的迄今尚未见报道 。用前者标记的探针，固然有很高的灵敏度，然因其半 衰期短，处理放射物质又需特殊的设备和条件，故很难为一般实验室所采用。相反，用生 物索标 的探针，其灵敏度虽略低于前者．但 因其制备过程简便，又可在较长时间内保 存，故易在一般实验室实行 最近，我们用生物素为标记物，制备 了贾第虫全基 因组 DNA探针，获得满意的效果。现将方法和结果作如下报道 。 1 材料和方法 1．1 贾第虫纯 (无菌)培养 按前人介绍的方法(Lu等，199o)将保存于液氮内的贾第虫(Giardialamb~ 纯培养滋 养体复苏、用改 良TYI—S-33培养基继续培养、传代 1．2 贾第虫全基因组 DNA的抽提 采用 CTAB法(Yap等，l987) 收获呈对数生长的虫体，在 已硅化的塑料离心管内 川 TE液 (40mM Tris-HC1，2mM EDTA，pH7．7)离 心 (2500rpm ／rain，5rain)洗 3 次。用少 许 TE液将 沉淀虫体悬浮。在 05ml的虫液 内加 1ml含新 鲜配制之蛋 白酶 K(1mg／m1)的裂解 液 (8％ TritonX一100，0．25M sucrose，5111M Tris-HC1，50mM EDTA、pH7．5)。置 65℃孵 育 l一 2h。加 lml已灭 菌 的 2％ CTAB (cetyltrime一 1．史 }993 l5门 14II收到，同q 7爿 26Ⅱ修 旧 维普资讯 86 动 物 学 研 究 15卷 thylammonium bromide，CTAB，溴化十六烷基三 甲铵)液。轻轻振荡至出现沉淀，离心 (3000rpm ／min，2min)，弃上清，将沉淀充 分溶于 400 1NE液(2．5M NaC11mM EDTA，pH77)内。加等体积氯仿，充分混匀。高速离心(12000rpm ／min，5min)，小 心吸取上层水相置另一离心管中，再加 2．5体积冷无水乙醇，使 DNA 沉淀。置一20℃过 夜。次 日再离 I~(10000rpm ／min， 10min)，弃上清，加 lm170％冷乙醇，同法 离心， 弃上清，充分控干，加 1mlTE液，使DNA充分溶解 。 1．3 贾第虫全基因组 DNA台量测定 用琼脂糖电冰法(彭秀玲等，1987)。琼脂糖浓度为0．8％(含0．6g／ml溴乙腚)。待 测 D‘NA 的加样量为 4pI(与 02倍体积载样缓冲液混合)。以标准 LDNA—Hin