第七章 番茄尖孢镰刀菌对土壤微生物群落结构的影响.docVIP

第章 番茄尖孢镰刀菌土壤微生物群落结构的影响 土壤中的微生物具有丰富的生物多样性，是生态系统中最活跃和最具影响力的组分之一，其生物多样性，既代表了土壤的生物活性，也反映了土壤生态胁迫机制对其微生物群落的影响。引入存在于活体微生物细胞膜的磷脂脂肪酸（phospholipid fatty acidPLFA），作为微生物的生物标记，被用于鉴定土壤微生物种类和识别微生物类群，具有较高的准确性、稳定性和敏感性，被广泛地应用于土壤微生物群落研究[]。刘波等采用磷脂脂肪酸（PLFAs）生物标记法，分析了杂交水稻根际土壤微生物群落结构及其与水稻特性的内在联系，为水稻栽培和品种选育提供了新的思路和方法[]。张秋芳等应用磷脂脂肪酸生物标记法，以烟田土壤为例，揭示了土壤微生物功能的动态变化，建立了一种用以评价土壤微生物群落功能的新方法[]。 本研究应用PLFAs技术，以四种不同性质的土壤为研究对象，分析尖孢镰刀菌对土壤微生物群落结构的影响，如土壤微生物生物总量及种类变化等，从而为枯萎病的致病机制及生物防治提供科学依据。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 供试菌株 番茄转gfp基因后的转化子FJAT-3993（经继代培养后荧光稳定性验证，其荧光稳定而均一）。 1.1.2 供试土壤 福州市乌龙江江边沙土、福州市某水稻基地水稻土、福建省农科院埔垱基地菜园土、福建省农科院埔垱基地泥潭土四种不同生境的土壤 1.1.3 培养基 PDB培养基：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，定容至1000 mL。 1.1.4 化学试剂及仪器 化学试剂：0.2M KOH甲醇溶液，1.0M冰醋酸溶液，正己烷，1：1的正己烷与甲基叔丁基醚混合液，26种BAME（Bacterial Acid Methyl Esters）Mix标准物，氢气，氦气，空气。 仪器：恒温摇床，血球计数板水浴锅，离心机，Agilent6890N型气相色谱仪，MIDI系统。1.2 方法 1.2.1 PLFAs法的提取过程和分析参考Frostegard和Kourtev的方法[103, 104]，具体步骤包括：（1）脂肪酸的释放与甲酯化：取10 g土样于50 mL离心管中，加入15 mL的0.2 mol/L的KOH甲醇溶液，斡旋振荡5 min，并于37 ℃水浴温浴1 h，每10 min斡旋一次。（2）中和溶液pH值：加入3 mL 1.0 mol/L的醋酸溶液中和，充分摇匀。（3）脂肪酸的萃取：加入10 mL正己烷，充分摇匀，800 r/min离心15 min，打开管盖，取上层正己烷于干净玻璃试管中，氮气吹干使溶剂挥发。（4）转移：在玻璃试管中加入1 mL体积比为1:1的正己烷：甲基丁基醚溶液，充分溶解3-5 min，转入GC小瓶，用于脂肪酸测定。（）土壤中脂肪酸生物标记总量和种类的 （）不同土壤特征脂肪酸生物标记含量的比较用16:0细菌特征脂肪酸；18:1ω9с真菌特征脂肪酸，10Me 17:0放线菌的特征脂肪酸，（）基于脂肪酸生物标记的聚类分析以脂肪酸生物量为样本构建矩阵；数据进行中心化，以兰氏距离为聚类尺度，用类平均法进行系统聚类，分析2 结果与分析2.1 PLFAs法分析转GFP基因镰刀菌对土壤微生物群落结构的影响 2..1 FJAT-3993对土壤中脂肪酸生物标记总量和种类的影响 FJAT-3993处理后对各土壤的影响不同，且各时间段的脂肪酸生物标记总量保持在77.05-89.15间，变化幅度较小。沙土和水稻土的生物总量在2 d至16 d保持稳定，在32 d总量都呈现出下降的趋势。菜园土脂肪酸生物标记总量总体上呈上升趋势。而泥潭土在2 d至4 d出现下降，此后脂肪酸生物标记总量逐渐由4 d时的82.75上升到32 d的85.68。 各土壤处理后，其种类变化幅度在21至40之间，差别不大。除沙土在8 d至16 d，菜园土4 d至8 d间种类出现减少，各土壤2 d至32 d种类总体上都呈逐渐增加的趋势（图6-12至图6-15）。 图6-12 FJAT-3993对沙土脂肪酸生物标记总量和种类的影响 Fig.6-12 The effects of FJAT-3993 to the sum and kinds of PLFAs on soil of the sand 图6-13 FJAT-3993对菜园土脂肪酸生物标记总量和种类的影响 Fig.6-13 The effects of FJAT-3993 to the sum and kinds of PLFAs on soil of the garden 图6-14 FJAT-3993对水稻土脂肪酸生物标记总量和种类的影响 Fig.6-14 The effects of FJAT-3993 to the sum and kinds of PL