猪SFN基因真核表达载体的构建及其对PK-15细胞增殖的影响.pdfVIP

猪SFN基因真核表达载体的构建 及其对PK-15细胞增殖的影响 顾玮1,2，程爽1,2，何启盖1,2 1.华中农业大学动物医学院，武汉430072.农业微生物国家重点实验室，武汉430070 摘要：[目的]构建SFN真核表达载体pcDNA3.1-SFN，并在PK-15细胞中表达，研究其对细胞增殖 的作用。[方法]从PK-15细胞中提取总RNA，应用RT-PCR法反转录合成cDNA，设计引物，扩增目的片 段，与pcDNA3.1载体连接后转化大肠杆菌DH5α，TSA平板筛选阳性克隆，提取质粒，阳性克隆经双酶切、 测序验证。用阳离子脂质体法将SFN基因转染PK-15细胞，并用间接免疫荧光法及蛋白免疫印迹检测重组 质粒的表达。流式细胞仪检测目的基因对细胞周期的影响。[结果]成功构建真核表达载体pcDNA3.1-SFN; 转染后的细胞成功超表达SFN基因。转染24h后，该基因能引起细胞G1期缩短，S期延长，造成细胞周期 的阻滞。[结论]该研究顺利表达真核载体pcDNA3.1-SFN，转染到猪肾细胞中能有效提高mRNA的表达水 平，为进一步研究PCV2在猪肾细胞中的增殖模式奠定了基础。 关键词：SFN基因；pcDNA3.1载体；细胞增殖;PCV2 国家农业行业科技国家生猪产业技术体系：第十四届全国规模化猪场主要疫病监控与净化专题研讨会论文集 121 1．1材料 1．1．1质粒和细胞和菌株 大肠杆菌感受态DH5 Q，pcDNA3．1载体，PK—15细胞，均由本实验室保存； 1．1．2主要试剂 Trizol DNA RNA提取液，RT—PCR反转录试剂盒，限制性内切酶(BamHI和HindⅢ)，T4 Ligase， DL Lipofactamine 司。PI染色剂购自SIGMA公司。 1．2方法 1．2．1总RNA的提取 比值及凝胶电泳鉴定其质量，确定其含量。 1．2．2引物设计 Permier 5．0软件设计 PCR引物，并由上海生工生物有限公司合成该引物。 SFN引物上游： ， 下 游 l 切位点，下游引物的5端加入BamH I酶切位点。上游引物含起始密码子，在起始密码子后插入Flag标 签，该引物扩增的靶序列全长747bp。 1．2．3目的片段的体外扩增及回收与纯化 将2×105个细胞加入lmL 延伸lOmin。取扩增终产物进行1％琼脂糖凝胶电泳并切下目的条带，根据胶回收试剂盒的说明从琼脂糖中 回收并纯化SFN的aDNA片段。 1．2．4重组体的构建和鉴定 经胶回收纯化的扩增产物和pcDNA3．1表达载体分别用BamH 琼脂糖凝胶电泳后回收目的基因与载体片段。用T4DNA连接酶连上上述两个酶切产物，4℃连接过夜后转 化入DH50感受态细胞。37℃培养过夜，经氨苄霉素抗性筛选重组表达载体后，挑取阳性菌落，摇菌过夜 后提取重组质粒。由南京金斯瑞公司完成对阳性克隆菌体的测序鉴定。 1．2．5 DcDNA3．卜SFN转染P卜15细胞及表达检测 圆形贴壁细胞。 质粒转染及蛋白表达的检测间接免疫荧光检测：将生长状态良好的PK—15细胞按2×105／孔接种于 ll 24孔细胞培养板中，无抗生素的DMEM培养液500L，37C，5％C02常规培养。待细胞贴于底壁，布满约 122 国家农业行业科技国家生猪产业技术体系：第十四届全国规模化猪场主要疫病监控与净化专题研讨会论文集 p 80％HP