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CTAB法小量制备植物基因组DNA 【原理 CTAB分离DNA的方法最初用于细菌，后来经修改用于从植物中获取DNA。CTAB（即十六烷基三乙基溴化铵）是一种阳离子去污剂。CTAB可与核酸形成复合物，该复合物仅溶于高盐溶液。此外，CTAB可十分有效地促进DNA和RNA与多糖的分离并去除多糖。可通过提高NaCl的浓度和PVP）和β-巯基乙醇（BME）——裂解混合液中的常见组分，是有效的还原剂，可将因酚类化合物氧化形成的醌降至最低。PVP在某种程度上相当于一种巨大的多糖，本质上它可占据物理空间从而增加其它分子的有效浓度并使得这些分子的沉淀更为容易。 任何基因组DNA制备技术的目的是分离足够纯的、高分子量的DNA。有两种因素会影响所分离DNA的尺寸：剪切力和核酸酶活性。因此裂解应当温和处理从而将剪切力降至最小。植物细胞富含核酸酶。大多数核酸酶需要Mg2+作为辅因子。为了降低核酸酶活性，组织应当快速冷冻并在包含有去污剂和高浓度EDTA的提取缓冲液中解冻。 【材料】 植物组织，新鲜 液氮 2× CTAB提取缓冲液 氯仿:异戊醇【24:1（v/v）】 异丙醇 洗涤缓冲液 95%乙醇 TE 缓冲液（pH 8.0） 10 mg/mL 无DNase的RNase A 金属匙 研钵和研杵 37°C和65°C水浴 微量离心机 移液器 涡旋仪 微型真空泵 记号笔 灭菌的1.5 mL一次性微量离心管 灭菌吸头 手套 【步骤】 1. 称取100 mg叶片组织，并在液氮预冷的研钵中研磨为细粉末。然后将粉末转移至1.5 mL微量离心管中。 2. 添加700 μL新鲜的2× CTAB提取缓冲液并用涡旋仪混匀。  3. 样品置于65°C水浴锅中30分钟，并每隔15分钟摇动离心管。将样品冷却至室温。 4. 每管添加700 μL氯仿:异戊醇（24:1），然后颠倒混匀数次。  5. 室温14,000 rpm离心5分钟。将上层水相转移至新的、已标记的1.5 mL微量离心管中。 注意：低于15°C将致使CTAB-核酸复合物沉淀。 6. 重复步骤4和5。(可以根据实际过程增减此步骤) 7. 向每管中添加等体积、4°C的异丙醇（约400~500 μL）。颠倒混匀，然后将管置于4°C、30分钟或者–20°C、15分钟。  8. 14,000 rpm离心10分钟。小心地弃去上清液避免丢失DNA沉淀。倒置离心管并在空气中干燥。 9. 用1 mL洗涤缓冲液清洗沉淀（约3分钟），14,000 rpm离心10分钟。小心弃去上清液。 10. 用1 mL 95%乙醇洗涤沉淀、于14,000 rpm离心10分钟，然后小心地弃去乙醇。倒置离心管在空气中干燥或者用真空泵抽吸15分钟。 11. 每个样品用20~50 μL TE溶解DNA，并添加1~2 μL无DNase的RNase A（10 mg/mL）。37°C孵育30分钟。 12. 确定浓度后，贮存于4°C（或长期贮存于–20°C）。 Small-scale Preparation of Plant Genomic DNA Using CTAB Principle The CTAB method of DNA isolation was initially used in bacteria and later modified to obtain DNA from plants. CTAB (cetyltrimethylammonium bromide) is one of cationic detergents. CTAB forms a complex with nucleic acids, and the complex is only soluble in high salt. Moreover, CTAB quite efficiently promotes the separation of both DNA and RNA from polysaccharides, and remove polysaccharides. CTAB is removed by raising the NaCl concentration and precipitating the nucleic acids. The residual CTAB is removed by washing the nucleic acid pellet with 76-80% ethanol; CTAB is more soluble in ethanol and is discarded with the wash solution. Tissues from some plants contain high concentrat