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第12章 高效液相色谱法 二、输 液 系 统 （1）输液泵应具备如下性能 ①流量稳定 ②流量范围宽 ③输出压力高 ④液缸容积小，适于梯度洗脱 ⑤密封性好，耐腐蚀。 1．色谱柱：是样品分离好坏的关键部件。 组成：固定相、柱管等 二极管阵列检测器 （diode array detector，DAD） 特点：在任一时间内，均可同时得到物质在不同波长下的吸收情况，即三维图谱 多 组 分 混 合 物 的 三 维 图 谱 缺点：①只能检测有紫外吸收的样品 ②流动相的选择受截止波长的限制 特点：浓度型 紫 外 可 见 外 光 光 度 计 优点：①样品不被破坏 ②灵敏度高，线性范围宽，对流动相流速变化不敏感，可用于递度洗脱 2、蒸发光散射检测器 （Evaporative light scattering detector，ELSD） 散射光（丁铎尔光效应） 蒸发漂移管 光电倍增管 定量关系： 散射光强只与溶质颗粒大小和数量有关 适用范围：任何挥发性小于流动相的组分，通用型和质量型检测器。 特点：消除了因溶剂和温度变化而引起基线漂移，适于梯度洗脱 荧 光 检 测 器 （fluorescence detector ,FD） 原理：利用物质吸收紫外光后，能发射 荧光的性质进行检测。 特点：高灵敏度、浓度型检测器 适用范围：能发出荧光的组分 * * high performance liquid chromatography HPLC 第4节 HPLC仪器构造 一、仪器构造 贮液瓶 泵 进样器 色谱柱 检 测 器 记录器 柱温箱 废液瓶 溶剂储液器（储液瓶） 作用：储存流动相 材质：玻璃或塑料瓶 2. 流动相处理 1）溶剂应经过0.45μm微孔滤膜过滤 2）溶剂脱气 气泡的影响：泵的工作、色谱柱的分离效果、检测器的灵敏度、基线稳定性 脱 气 方 法 （1）离线脱气法 a 抽真空脱气 适用：单一溶剂的脱气；对于多无溶剂体系，每种溶剂应先脱气后混合。 b 超声波振荡脱气 用超声波振荡10-30min即可。 优点：方便，快捷 缺点：脱气效率不高 c 吹氦脱气 适用：所有的溶剂 优点：脱气效果好 缺点：影响混合溶剂的比例、昂贵 （2）在线脱气法 优点：脱气效果好，适用于多元溶剂系统。 3. 高 压 输 液 泵 （2）柱塞往复泵 柱塞往复泵 缺点：输液脉动性大 （3）泵 的 使 用 和 维 护 ①防止固体微粒进入泵体，因此应过滤流动相。 防止空泵运转 工作压力不超过规定的最高压力 流动相应脱气，以免泵压不稳 分析结束后，应清洗泵。 4. 梯 度 洗 脱 装 置 梯度洗脱有两种方式 低压梯度（外梯度）、高压梯度（内梯度） 低压梯度：先预混合后，再加压 缺点：易产生气泡 优点：成本低廉 适用: 两种或多种溶剂体系 高压梯度：先加压后，再混合 优点：混合精度高 缺点：需两个高压泵，价格较昂贵 适用: 二元体系 ? 六通阀手动进样器 三、进样系统 1 2 3 4 5 6 泵 色谱柱 色谱柱 1 2 3 4 5 6 泵 定量管 Load Inject 进样体积：5、10、20、50μl，等 进样针：用HPLC专用平头微量注射器 ? 自动进样装置 自动完成定量取样、洗针、进样、复位等过程。 自动化操作，适合大量样品的分析 四、分 离 系 统 分析型柱：内径 2-4.6mm，柱长10-30cm 制备型柱：内径20-40mm，柱长10-30cm 1）流动相的流动方向应与箭头所指方向一致 2）避免压力、温度和流动相的组成比例急剧变化及震动 3）及时清除柱内杂质 色 谱 柱 的 使 用 2. 保 护 柱（预柱） 特点：接在分析柱前端 固定相与分析柱相同 短柱（5~20mm） 可经常、方便更换 作用：保护、延长分析柱寿命 3. 柱 温 箱 使色谱柱恒温的装置，温度控制一般在20~40℃ 柱效评价： R，n，T（拖尾因子） 4. 色 谱 柱 的 评 价 05版药典规定：在建立分析方法时，需进行“色谱条件与系统适用性实验” 新购买的柱，也需检验柱性能 五、 检 测 器 紫外检测器（UV） 蒸发光散射检测器（ELSD） 荧光检测器（FD） 电化学检测器（ECD） 示差折光检测器（RID） 原理：Uv-vis分光光度计 定量关系： Lambert-Beer定律 A=kc 1、紫外检测器 （Ultraviolet detector , UVD） 流通池 类型：可变波长型 紫 外 检 测 器 二极管阵列检测器 （1）可变波长紫外检测器 （variable wavelength