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分光光度技术 有色溶液对光线有选择性的吸收作用，不同物质由于其分子结构不同，对不同波长线的 吸收能力也不同，因此，每种物质都具有其特异的吸收光谱。有些无色溶液，光虽对可见 光无吸收作光光度技术吸收用，但所含物质可以吸收特定波长的紫外线或红外线。分光谱来 鉴定物质性质及含量的技术，其理论依据是(分光光度法)主要是指利用物质特有的Lambert 和Beer 定律。 分光光度法是比色法的发展。比色法只限于在可见光区，分光光度法则可以扩展到紫 外光区和红外光区。比色法用的单色光是来自滤光片，谱带宽度从40－120nm，精度不高， 分光光度法则要求近于真正单色光，其光谱带宽最大不超 3－5nm，在紫外区可到1nm 以 下，来自棱镜或光栅，具 较高的精度。 基本原理 一、光的基本知识 光是由光量子组成的，具 二重性，即不连续的微粒和连续的波动性。波长和频率是光 的波动性和特征，可用下式表示： Ｃ λ＝─── Ｖ 式中 λ为波长，具 相同的振动相位的相邻两点间的距离叫波长。Ｖ为频率，即每秒 钟振动次数。Ｃ为光速等于299770 千米／秒。光属于电磁波。自然界中存在各种不同波长 的电磁波，列成表1-1所示的波谱图。分光光度法所使用的光谱范围在200nm-10 μ（1μ= 1, 000nm ）之间。其中200nm－400nm 为紫外光区，400nm－760nm 为可见光区，760nm－ 10,000nm 为红外光区。 二、朗伯－比尔（Lambert-Beer）定律 朗伯－比尔定律是比色分析的基本原理，这个定律是有色溶液对单色光的吸收程度与溶 液及液层厚度间的定量关系。此定律是由朗伯定律和比尔定律归纳而得。 1.朗伯定律 一束单色光通 溶液后，由于溶液吸收了一部分光能，光的强度就要减 ：若溶液浓度 不变，则溶液的厚度愈大 （即光在溶液中所经 的途径愈长），光的强度减低也愈显著。 2.朗伯－比尔定律 如果同时考虑吸收层的厚度和溶液浓度对光吸收的影响，则必然将朗伯定律和比尔定律 合并起来，吸光度与溶液的浓度和液层的厚度的乘积成正比，这就是朗伯－比尔定律。 分光光度计基本结构简介 能从含 各种波长的混合光中将每一单色光分离出来并测量其强度的仪器称为分光光 度计。 分光光度计因使用的波长范围不同而分为紫外光区、可见光区、红外光区以及万用 （全 波段）分光光度计等。无论哪一类分光光度计都由下列五部分组成，即光源、单色器、狭缝、 样品池，检测器系统。如图1-1 所示。 一、光源 要求能提供所需波长范围的连续光谱，稳定而 足够的强度。常用的 白炽灯（钨比灯、 卤钨灯等），气体放电灯 （氢灯、氘灯及氙灯等），金属弧灯 （各种汞灯）等多种。 钨灯和卤钨灯发射320－2000nm 连续光谱，最适宜工作范围为360－1000nm，稳定性好， 用作可见光分光光度计的光源。氢灯和氘灯能发射150－400nm 的紫外结，可用作紫外光区 分光光度计的光源。红外线光源则由纳恩斯特（Nernst）棒产生，此棒由Ｚr Ｏ2:Ｙ2Ｏ3=17:3 （Ｚr 为锆，Ｙ为钇）或Ｙ2Ｏ3，ＧeＯ2 （Ｇe 为铈）及Ｔh Ｏ2 （Ｔh 为钍）之混合物制成。汞灯发射的不是连续光谱， 能量绝大部分集中在253.6nm 波 长外，一般作波长校正用。钨灯在出现灯 发黑时应及更换，如换用的灯型号不同，还需要 调节灯座的位置的焦距。氢粘及氘灯的灯 或窗口是石英的，且 固定的发射方向，安装时 必须仔细校正接触灯 时应戴手套以防留下污迹。 二、分光系统（单色器） 单色器是指能从混合光波中分解出来所需单一波长光的装置，由棱镜或光栅构成。用玻 璃制成的棱镜色散力强，但只能在可见光区工作，石棱镜工作波长范围为185￣4000nm，在 紫外区 较好的分辩力而且也适用于可见光区和近红外区。 棱镜的特点是波长越短，色散 程度越好，越向长波一侧越差。所以用棱镜的分光光度计，其波长刻度在紫外区可达到 0.2nm，而在长波段只能达到5nm。 的分光光系统是衍射光栅，即在石英或玻璃的表面上 刻划许多平行线，刻线处不透光，于是通 光的干涉和衍射现象，较长的光波偏折的角度大， 较短的光波偏折的角度小，因而形成光谱。 三、狭缝 狭缝是指由一对隔板在光通路上形成的缝隙，用来调节入射单色光的纯度和强度，也直 接影响分辩力。狭缝可在0－2mm 宽度内调节，由于棱镜色散力