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一 r}}}}塑t竺丝 一一一一一一 烟粉虱可能就是B型烟粉虱 (银叶粉虱)。 B型烟粉虱主要是通过世界各国的花卉贸易传播扩散的，在许多国家都有发生，亚 洲的以色列、日本以及我国的台湾岛都有B型烟粉虱的发生。加之，我国近 10年来，与 国外的交流和沟通日益频繁，B型烟粉虱极有可能已传入我国大陆。大多数国家除了入 侵的B型烟粉虱外，都有一种或一种以上的本土生物型存在，我国幅员辽阔，气候环境 差异较大，烟粉虱的其它生物型很有可能存在。烟粉虱的发生和危害己引起全世界昆虫 学家的重视，许多国家都对此展开了立题、研究，跨国的国际合作工作也开展的有声有 色，如欧洲的烟粉虱问题研究组和世界烟粉虱研究信息交流协会。搞清我国烟粉虱的生 物型及分布是采取合理防治措施、与国外研究接轨的前提，显的尤为迫切。在上述背景 的推动 卜，作者展开了本文的研究工作。 第四节 研究的主要内容和所用的两种遗传标记方法 1本项研究的主要内容 1)2000年北京重发区粉虱的形态鉴定以及烟粉虱、B型烟粉虱 (银叶粉虱)与温 室白粉虱三者的区别 2)银叶反应的生物测定B型烟粉虱 (银叶粉虱)和非B型 3)RAPD-PCR分析烟粉虱生物型 4)rDNA-ITSI分析烟粉虱生物型 5)B型烟粉虱在北京田间的发生情况 2本研究使用的两种遗传标记方法 由于在本研究开始进行之时，国内有关烟粉虱方面的报道很少，对其生物型的研究 更是空白，而生物形态上差异又不足以有效的区分它们，现实的对策便是采用随机扩增 多态性DNA的聚合酶链反应技术 (RAPD-PCR)定性对它们进行区分后，在此基础上进行 核糖体rDNA的间隔区ITSI序列的单位点测定。采用的两种分子标记方法各有优劣，第 一，与其它多位点DNA标记，如扩增片段长度多态性 (AFLP)等相比，RAPD-PCR具有操 作简便易行，实验成本低，对样品DNA的质和量的要求不高等优点，并且国外在这方面 已有相当多的研究，证明此技术在区分烟粉虱生物型上是非常有效的，技术较成熟。但 其稳定性和可比性不及后者;第二，rDNA-ITSI的扩增、测序分析稳定性很好，允许我 们把其与基因库(GeneBank)中世界各国已登录的序列进行比较，来确定我国生物型的分 类地位，但其操作复杂，费用高，风险大。 1,绷u,, 中国农业大学博士学位论文 2.1随机扩增多态性DNA的某合醉链反应技术(RandomAmplifiedPolymorphicDNA-PCR, 简称RAPD-PCR) RAPD技术是自1990年发展起来的一项DNA水平上的大分子多态检测技术。其理论 依据是:不同物种的基因组中与引物相匹配的碱基序列的空间位置和数目都有可能不同， 所以扩增产物的大小和数量也有可能不同，这些差异可以通过凝胶电泳显示出来。基于 这种理论，Williams将通常PCR扩增中使用的两个特定序列的引物改为单一的由10个 碱基构成的随机序列引物，对鉴别目标的DNA进行随机性扩增，扩增产物(大小不一DNA 片段)形成具有一定特征的谱带，其中的特异性条带即可作为相关检测群体的识别根据。 同时运用大量不同序列的引物进行扩增，使DNA多态性充分展现(Williamsetal.1990). Williams巧妙的思路使RAPD技术表现出独到的特点和优势。第一，RAPD技术可以 在对物种没有任何分子遗传背景了解的情况下，对物种的基因组进行DNA片段多态性分 析。第二，RAPD技术引物的种类很多，对多种引物的详细筛选，使得两个基因组之间微 小的差异也能被反映出来。第三，RAPD技术对材料要求低，操作简便，所需时间短，可 在 7-24小时内完成，这些使其成为目前研究成本相对较低的一种分子生物学方法。第 四，RAPD技术效率高，所需材料的量很少，并且对样品DNA的质量要求不高，便于对大 量的、不方便严格保存的小型昆虫进行研究。在烟粉虱己有一些研究报告，RAPD-PCR方 法仅需一头烟粉虱即可进行多种引物扩增，并有一些行之有效的随机引物报导，对烟粉 虱生物型的区分是非常有用的。 RAPD技术也存在一些缺点，需要在试验和统计分析中加以注意和克服。第一，RAPD 多数位点的标记带为显性的特点，不能区分纯合体和杂合体。第二，R人PD扩增图谱中某 些弱