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免疫荧光技术操作步骤 一. 直接免疫荧光法测抗原 基本原理 将荧光素标记在相应的抗体上，直接与相应抗原反应。其优点是方法简便、特异性高，非特异性荧光染色少，相对使用标记抗体用量偏大。 试剂与仪器 磷酸盐缓冲盐水（PBS）：0.01mol/L，pH7.4 荧光标记的抗体溶液：以 0.01mol/L，pH7.4 的 PBS 进行稀释 缓冲甘油：分析纯无荧光的甘油 9 份+ pH9.2 0.2M 碳酸盐缓冲液 1 份配制 搪瓷桶三只（内有 0.01mol/L，pH7.4 的 PBS 1500ml） 有盖搪瓷盒一只（内铺一层浸湿的纱布垫） 荧光显微镜 玻片架 滤纸 37℃温箱等。 实验步骤 1. 滴加 0.01mol/L，pH7.4 的PBS于待检标本片上，10min后弃去，使标本保持一定湿度。 2. 滴加适当稀释的荧光标记的抗体溶液，使其完全覆盖标本，置于有盖搪瓷盒内，保温一 30min 定时间（参考：30min）。 3. 取出玻片，置玻片架上，先用 0.01mol/L，pH7.4 的 PBS 冲洗后，再按顺序过 0.01mol/L， pH7.4 的 PBS 三缸浸泡，每缸 3-5 min，不时振荡。 4. 取出玻片，用滤纸吸去多余水分，但不使标本干燥，加一滴缓冲甘油，以盖玻片覆盖。 5. 立即用荧光显微镜观察。观察标本的特异性荧光强度，一般可用“+”表示： （-）无荧光；（±）极弱的可疑荧光；（+）荧光较弱，但清楚可见；（++）荧光明亮；（+++ --++++）荧光闪亮。待检标本特异性荧光染色强度达“++”以上，而各种对照显示为（±） 或（-），即可判定为阳性。 注意事项 1. 对荧光标记的抗体的稀释，要保证抗体的蛋白有一定的浓度，一般稀释在 1：20-100 之 间，要自行摸索最佳梯度，建立最好的稀释比例，抗体浓度过低，会导致产生的荧光过弱， 影响结果的观察。 2. 染色的温度和时间需要根据各种不同的标本及抗原而变化，染色时间可以从 10 min 到数 小时，一般 30 min 已足够。染色温度多采用室温（25℃左右），高于 37℃可加强染色效果， 但对不耐热的抗原（如流行性乙型脑炎病毒）可采用 0-2℃的低温，延长染色时间。低温染 色过夜较 37℃30 min 效果好的多。 3. 为了保证荧光染色的正确性，首次试验时需设置下述对照，以排除某些非特异性荧光染 色的干扰。 （1）标本自发荧光对照：标本加 1-2 滴 0.01mol/L，pH7.4 的 PBS。 （2）特异性对照（抑制试验）：标本加未标记的特异性抗体，再加荧光标记的特异性抗 体。 如果标本自发荧光对照和特异性对照呈无荧光或弱荧光， 待检标本呈强荧光，则为特异性阳性染色。 4. 一般标本在高压*灯下照射超过 3min，就有荧光减弱现象，经荧光染色的标本最好在当天观察，随着时间的延长，荧光强度会逐渐下降。 二. 间接免疫荧光法测抗原 基本原理 染色程序分为两步，第一步，用已知未标记的抗体（待检标本）加到已知抗原（待检标本） 标本上，在湿盒中 37℃保温 30min，使抗原抗体充分结合，然后洗涤，除去未结合的抗体。 第二步，加上荧光标记的抗球蛋白抗体或抗 IgG、IgM 抗体（通常为荧光标记的对应二抗）。 如果第一步发生了抗原抗体反应，标记的荧光标记的二抗就会和已结合抗原的抗体进一步结 合，从而可鉴定被检测抗原。 试剂与仪器 磷酸盐缓冲盐水（PBS）：0.01mol/L，pH7.4 缓冲甘油：分析纯无荧光的甘油 9 份+ pH9.2 0.2M 碳酸盐缓冲液 1 份配制。 荧光标记的抗人球蛋白抗体：以 0.01mol/L，pH7.4 的 PBS 进行稀释 。 搪瓷桶三只（内有 0.01mol/L，pH7.4 的 PBS 1500ml） 有盖搪瓷盒一只（内铺一层浸湿的纱布垫） 荧光显微镜 玻片架 滤纸 37℃温箱等。 实验步骤 1. 滴加 0.01mol/L，pH7.4 的 PBS 于未知抗原标本片，10min 后弃去，使标本片保持一定湿度。 2. 滴加以 0.01mol/L，pH7.4 的 PBS 适当稀释抗体，覆盖未知抗原标本片。将玻片置于有盖搪瓷盒内，37℃保温 30min。 3. 取出玻片，置于玻片架上，先用 0.01mol/L，pH7.4 的 PBS 冲洗 1-2 次，然后按顺序过0.01mol/L，pH7.4 的 PBS 三缸浸泡，每缸 5min，不时振荡 。 4. 取出玻片，用滤纸吸去多余水分，但不使标本干燥，滴加一滴一定稀释度的荧光标记二 抗 5. 将玻片平放在有盖搪瓷盒内，37℃保温 30min。 6. 重复操作 3。 7. 取出玻片，用滤纸吸去多余水分，滴加一滴缓