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F=KC 形式相同于比尔定律——一定条件下，荧光强度与荧光物质的浓度成正比 荧光强度 F正比于吸收的光量I和荧光效率? ： F∝? Ia 由朗-比尔定律： Ia = I0(1-e-? l c ) F∝? I0(1-10-? l c ) = ? I0(1-e-2.3? l c ) 浓度很低时，将括号项近似处理后： F= 2.3 ? I0 ? l c = Kc 定量依据： 荧光定量分析 F=KC 适用条件： ①溶液很稀，A≤0.05； ②线性范围：10-5~100ug/ml。 1. 标准(工作)曲线法： F 0 C Fx Cx 2. 比例法： 扣除空白时： 第四节 荧光分析法的应用示例 (1)无机化合物的分析 在紫外光照射下会发生荧光的无机化合物很少，主 要依赖于有机试剂形成的螯合物。 直接荧光测定法 其中，较常测定的元素有：Be、Al、B、Ga、Se、Mg、Zn、Cd与某些稀土元素；测定的灵敏度有些可以达到10-10; 某些元素虽然不与有机试剂形成发荧光的配合物，但是它会与发荧光的配合物争夺配位体，组成不发荧光的配合，使其产生荧光熄灭，由荧光熄灭的强度此该元素的含量。 较常测定的元素有：F、S、Fe、Ag、Co、Ni、Cu、Mo、W 荧光熄灭测定法 自从1867年Goppelsroder进行了历史上首次的荧光分析工作，应用铝—桑色素配合物的荧光进行铝的测定以来，采用有机试剂可以测定70多种元素。 催化荧光测定法 较常测定的元素有：Cr、Nb、U、Te、Pb 某些元素虽然与有机试剂形成发荧光的配合物，但是反应速度慢，在某些微量元素的催化下，反应速度会加快，在特定的时间内可用来测定微量元素。 低温荧光测定法 常测定的元素有：Cu、Be、Fe、Co、Os、Ag、Au、Zn、Al、Ti、V、Mn、Er、H2O2、CN 溶液温度的降低，显著增强溶液的荧光强度。液氮 －1960C 较常测定的元素有：Ce、Sm、Tb 等稀土元素 　　　　　　　　　Sb、V、Pb、Bi、Nb、Mn 固体荧光测定法 固体荧光法在荧光分析中也经常用到。 (2)生物与有机化合物的分析 荧光分光光度法的应用 实例：尿液中维生素B2的测定：维生素B2(核黄素)在430nm~440nm蓝光照射下会发生绿色荧光，λem=535nm。在pH=6~7的溶液中荧光强度最大，而在pH=11时荧光消失； 但在碱性溶液中经光线照射发生分解作用或在酸性KMnO4氧化下会生成荧光强度比维生素B2强得多的光黄素，并可溶于氯仿。 利用此性质可提高测定的灵敏度及选择性。 分子荧光分析法的测定条件选择 1. 仪器最佳测定条件 ①在非参比法测量技术中，灯电流调到最大允许值，可提高测定灵敏度。 ②作定性测定时狭缝宜窄一些，能获得较纯的谱带及精细的光谱；作定量测定时狭缝不宜过小，以增加荧光强度，提高测定灵敏度。 分子荧光分析法的测定条件选择 1. 仪器最佳测定条件 ③样品池放在光源前进方向的垂直位置。池的内径及玻壁厚薄必须一致，否则要作校正。 ④每次测量前仪器必须经过标定。在整个测量过程中样品液的光照不宜过久，仪器应始终保持在散热状态。 2. 样品前处理过程中的最佳条件 ①溶剂和化学试剂必须无荧光性杂质。 ②样品溶液有适宜的pH值(保持最强的荧光存在形式)。 ③测定溶液的浓度适当(ug/ml级)。 ④溶液的荧光强度随温度增高而降低，测定对温度敏感物质时，最好恒温。 小 结 分子荧光是由基态分子受一定波长的光(紫外、可见、红外)激发而产生的，是由第一电子激发单线态的最低振动能级开始的。 分子荧光可以用于确定化合物的结构及含量。 小 结 激发光谱和荧光光谱都是荧光物质的特征光谱。 激发光谱中纵坐标为荧光强度，横坐标为激发光(吸收光)波长；而荧光光谱中纵坐标为荧光强度，横坐标为荧光(发射光)波长。 小 结 影响荧光强度的因素 ①取代基的影响 ②分子共面性的影响 ③不饱和稠环的影响 ④环境的影响 小 结 荧光分析的定量方法——标准曲线法、比例法。 荧光测定的定量公式——F=KC。要求： ①溶液的吸光度A≤0.05； ②线性范围：10-5~100ug/ml。 第五章 分子荧光分析法 第一节 基本原理 第二节 仪器 第三节 定性与定量分析 第四节 荧光新技术和应用示例 第五章 分子荧光分析法 荧光：某些结构的分子或原子受一定波长的光激发（产生吸收），由基态变为激发态；在从激发态返回到基态时，会发射出比吸收光波长更长的光——荧光。 荧光分析 原子荧光