以沙门氏杆菌菌毛为载体的丙型肝炎疫苗的制备研究.pdfVIP

以沙门氏杆菌菌毛为载体的丙型肝炎疫苗的制备研究 1，2 1 1 1 1 1 周寻 ，黄鹤 ，邓璐瑶 ， 朱蕴兰 ，张秀春 ，王月丹 1 北京大学医学部免疫学系 2 北京大学附中 摘要：细菌菌毛作为表达载体用于表达外源多肽或蛋白有诸多优势，已有研究通过基因置换 技术成功地在沙门氏菌菌毛上表达一段外源多肽并能够被抗体识别。利用这项技术我们构建 了菌表上表达HCV 抗原表位的重组Salmonella typ himurium LT2 菌株，对提高HCV 抗原表 位疫苗的免疫原性提供了新的途径。 关键词：沙门氏菌，丙性肝炎病毒，表位，疫苗，基因置换 丙型肝炎是由丙型肝炎病毒 （HCV）引起的一种严重威胁人类健康的病毒性传染病，HCV 可以通过输血等方式传播，该病毒感染人体后 70 %～85 %可发展成慢性感染,常常引起肝脏 的损害和肝硬化，甚至肝癌，最终导致患者死亡。在我国，HCV 的人群感染率约 3.2%，我 国的丙型肝炎患者总人数在 4000 万以上，全球约有 1.7~2 亿 HCV 感染者。由于丙型肝炎是 一种病毒性疾病，该病的治疗目前还没有特效药物，同时也没有发现有效的预防疫苗，因此 丙肝的防治是国内外医学研究的重要课题。 然而，由于HCV 复制力差,体内滴度低,不易传代培养, 免疫原不易大量制备。HCV 感染 力弱,目前没有理想的细胞模型,动物模型，除黑猩猩外,其他动物都不能为HCV 所感染，目 前国内外均未能成功的研制出具有保护性的丙肝疫苗。现已证实，在病毒感染过程中，抗病 毒的特异性杀伤T细胞 （CTL）是清除潜伏病毒，终止慢性感染的主要免疫成分，丙型肝炎病 毒中也具有能被机体CTL识别的抗原表位，但由于这些表位均只有 9 个左右的氨基酸残基组 成，抗原性较弱，因此至今丙型肝炎病毒疫苗的研究仍停留在实验室的研究阶段。外源蛋白 展示表达于细菌表面以提高抗原的免疫原性研究，最早报道于上世纪 80 年代中期，1999 年 沙门菌菌毛的外源多肽展示表达体系也构建成功。利用这种方法，可以将原本免疫原性较弱 的抗原序列表达在抗原性很强的沙门氏菌的菌毛上，一方面可以增强其免疫原性，另一方面 可以由沙门氏菌携带通过肠黏膜，被黏膜下的树突状细胞加工并提呈给CTL，产生保护性的 细胞免疫应答[1-3]。本研究通过基因置换技术将编码HCV特异性表位的序列加入到沙门氏菌的 菌毛中，形成稳定的具有HCV表位的重组沙门氏菌菌毛疫苗。 材料与方法 1．1 HCV抗原表位表达质粒的构建 根据质粒pHSG415 中起始密码子ATG3 ’ 端的核苷酸序列和HCV抗原表位末端序列合 成引物（引物序列为：5’- CTGCAAAGCGAC GTCCGTAAAGCAGCATTCCTTCCATCT GATTTCTTCCCAAGTGTAGCAGCAGGCCAGGGTGCGGATAACAGT 和5’- GACTCTGCA G AGGGTTCGTTTAA TGTGA ），然后进行PCR（条件为：95℃ 45s，55℃ 45s，72℃ 2min， 30个循环后72℃ 10min；高保真DNA聚合酶为日本宝生物产品）。将PCR产物和改造后的质粒 pHSG415 （加拿大White 博士赠送）用限制性内切酶PstI，AatII （NEB产品）进行酶切，然 后用连接酶（Promega产品）进行连接得到重组质粒[1,4]。 1．2 含HCV抗原表位的Salmonella typhimurium LT2菌株的制备 将经重组质粒转化后的菌株在42 ℃含抗生素的平板中生长，由于质粒在高温下不进行复 制而易于丢失；同时在氯霉素和卡那霉素（SIGMA公司产品）的选择压力下，含抗性基因的 -1- 重组质粒只有通过同源重组整合到细菌染色体中以保证细菌的生长。经数次传代，确保同源 重组的效率。此后，在28 ℃不