恒河猴外周血单核巨噬细胞体外培养方法建立优秀参考文档.pdfVIP

2015年 2月 中国实验动物学报 February2015 第 23卷 第 1期 ACTA LAB0RAT0RIUM ANIMALISSCIENTIA SINICA VOl23 NO 1 恒河猴外周血单核巨噬细胞体外培养方法的建立 桑明，代 明，周立，刘金彪 ，郭铭，马同翠，肖前浩，霍文哲 (武汉大学动物实验 中6／动物生物安全三级实验室 ，病毒学国家重点实验室 ，武汉 430071) 【摘要】 目的 建立一种简单、经济、高效的培养恒河猴外周血单核巨噬细胞 (monocyte—derivedmacrophage， MDM)的方法 。方法 用肝素钠抗凝管采集成年恒河猴 (Macacamulatta)全血 ，密度梯度离心法分离外周血单核细 胞 (peripheralbloodmononuclearcells，PBMCs)。同时用无抗凝剂采血管采集 同一 只猴外周血 ，自凝后分离mL清。 将猴 PBMCs置于 CellBINDSurface的96孑L(0．8×10 个细胞／孑L)或48孔培养板 (3×10。个细胞 ／孔)中，用含不 同 百分 比的猴 自体血清或胎牛血清 (fetalcalfserum，FCS)的 RPMI1640培养液培养 24h后洗弃未贴壁细胞 ，加入含 有猴 白体血清或 FCS的新鲜培养基继续培养7d后观察细胞形态学。分化 良好 的猴单核 巨噬细胞贴壁能力强，占 据板底大部分区域。胞体形态多样 ，多数呈长梭形。用 巨噬细胞标记受体 (CD14)抗体染色判断细胞纯度 。并用 细菌 内毒素 (LPS)刺激分化的巨噬细胞 ，检测巨噬细胞炎性因子的表达 。此外 ，用猴艾滋病毒 (SIVmacl7E—Br、SIV— mac251)和人一猴嵌合体艾滋病毒 (SHIVKU1)感染分化 良好 的猴 巨噬细胞 ，检测病毒在猴 巨噬细胞 中的复制 。结 果 在含 2％猴 自体血清 的 RPMI1640培养条件下 ，大多数 (85％)猴单核细胞能在 24h内贴壁 ，体外分化 5～7 d后 ，猴 巨噬细胞纯度大于96％。相比而言 ，含较高浓度 (4％，8％或 10％)猴 自体血清或 FCS的 RPMI1640培养基 对猴单核细胞 的贴壁和分化作用较差 。分化 良好的猴 巨噬细胞对 LPS刺激敏感 ，可产生多种 巨噬细胞炎性因子 。 此外 ，这些细胞对 SIV或 SHIV均易感 ，产生感染性病毒 。结论 含 2％猴 自体血清的 RPMI1640培养基适于原代 猴单核细胞 的贴壁和分化 。该方法简单 、花 费少 ，无需生长因子 ，且分化效果好 ，是培养猴艾滋病毒及开展相关免 疫 学实验的重要手段 。 【关键词 】 恒河猴 ；艾滋病毒 ；单核细胞 ；巨噬细胞 【中图分类号】Q95—33 【文献标识码】A 【文章编号】1005—4847(2015)O1—0018-07 Doi：10．3969／j．issn．1005—4847．2015．O1．004 Establishmentofam ethodforcultureinvitroofperipheral bloodm onocytesfrom rhesusmacaque 研SANGMing，DAIMing，ZHOULi，LIUJin—biao，GUOMing，MATong·cui，XIAOQian—hao，HOWen—zhe 究 报 H (CenterforAnimalExperiment／ABSL—IIILaboratory，StateKeyLaboratoryofVirology， ～ 告 WuhanUniversity，Wuhan430071，China) 【Abstract】 objectives Toestablishasimple，inexpensiveandefficienttechniqueofrinvitrocultureotm‘on