热不对称交错PCR克隆bapt基因侧翼序列.pdfVIP

2015年 1月 化 学 工 业 与 工 程 第 32卷 第 1期 Jan．2015 CHEMICAL INDUSTRY AND ENGINEERING Vo1．32 NO．1 doi：10．13353／j．issn．1004．9533．2015．01．012 热不对称交错 PCR克隆bapt基因侧翼序列 林春燕，郭 婧 ，赵广荣 (天津大学化工学院，系统生物工程教育部重点实验室，天津 300072) 摘要：紫杉醇是来源于红豆杉植物的抗癌药物 ，广泛应用于乳腺癌和小细胞肺癌等临床 治疗。巴 卡亭Ⅲ．氨基苯基丙酰．13．O一转移酶基 因(bapt)的表达是紫杉醇合成的瓶颈 ，解析该基 因侧翼序列 是人工调控 紫杉醇合成途径 的前提 。采用同源克隆和热不对称 交错 PCR技术 ，扩增获得 bapt基 因 及其侧翼的染色体序列5．6kb。生物信息学分析表明，bapt基 因含有2个外显子和 1个内含子 ，编 码区长度 1338bp；5’端侧冀序列 l604bp，包含启动子元件 ；3’端 2582bp，含有终止子元件 242bp。发现的转录元件将应用于代谢工程改造红豆杉细胞 ，提高紫杉醇产量。 关键词 ：红豆杉；紫杉醇；热不对称 交错 PCR；巴卡亭Ⅲ一氨基苯基 丙酰一13-O-转移酶 ；3一氨基-3-苯基 丙酰转移酶基 因 中图分类号 ：Q37 文献标志码 ：A 文章编号：1004—9533(2015)叭 一0059—05 CloningtheFlankingSequencesofbaptbyThermalAsymmetric InterlacedPCR LinChunyan，GuoJing，ZhaoGuangrong (KeyLaboratoryofSystemsBioengineering，SchoolofChemicalEngineeringandTechnology，TianjinUniversity，Tianjin300072，China) Abstract：Taxolisanaturalanticancerdrugproducedfrom Taxusspecies，andwidelyusedintheclinical treatmentofbreastcancerandsmallcelllungcancer．The expression ofbaccatin 111-aminopheny1pro— panoyl-13-O—transferase(bapt)geneislimitedfortaxolbiosynthesis，anditsflankingsequencesarepre- requisiteofrregulatingtaxolproduction．W eclonedbaptgeneand itsflankingsequenceswiththelength of5．6 kbbyhomologouscloningand thermalasymmetric interlacedPCR．Bioinofrmaticanalysisofthe sequenceshowed thatbaptgene containstwo exons and one intron with the open reading flame of 1338bp．5 ‘Flankingsequenceof1604bpcontainsthepromoterand3’flankingsequenceof2582bp contains242bplongterminator．Theregulatoryelementsdiscoveredinthisresearchwouldbehelpfulto improvetheproductionoftaxolthroughmetabolicallyengineeringtax